Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Polymerasekjedereaksjon og dot-blot-hybridisering for Leptospira-deteksjon i vannprøver

Published: June 14, 2024 doi: 10.3791/65435
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 1
1Department of Molecular Biology and Histocompatibility, General Hospital “Dr. Manuel Gea González”, 2Diagnostic Laboratory-Bacteriology, Leptospira Section, Department of Microbiology and Immunology, Veterinary Medicine Faculty, UNAM, 3Department of Ecology of Pathogens, General Hospital “Dr. Manuel Gea González”

Summary

I denne studien ble en dot-blot-applikasjon designet for å oppdage Leptospira fra de tre hovedkladene i vannprøver. Denne metoden tillater identifisering av minimale DNA-mengder spesifikt målrettet av en digoksigenin-merket sonde, lett detekteres av et anti-digoksigeninantistoff. Denne tilnærmingen er et verdifullt og tilfredsstillende verktøy for screeningformål.

Abstract

Dot-blot er en enkel, rask, sensitiv og allsidig teknikk som muliggjør identifisering av minimale mengder DNA spesifikt målrettet ved sondehybridisering i nærvær av bærer-DNA. Den er basert på overføring av en kjent mengde DNA til en inert fast støtte, slik som en nylonmembran, ved bruk av dot-blot-apparatet og uten elektroforetisk separasjon. Nylonmembraner har fordelen av høy nukleinsyrebindingskapasitet (400 μg / cm2), høy styrke, og er positivt eller nøytralt ladet. Sonden som brukes er et svært spesifikt ssDNA-fragment på 18 til 20 baser som lenge er merket med digoksigenin (DIG). Sonden vil konjugere med Leptospira DNA. Når sonden har hybridisert med mål-DNA, detekteres den av et anti-digoksigeninantistoff, slik at den enkelt kan detekteres gjennom utslippene som avsløres i en røntgenfilm. Prikkene med en utslipp vil tilsvare DNA-fragmentene av interesse. Denne metoden benytter sondens ikke-isotopiske merking, som kan ha en svært lang halveringstid. Ulempen med denne standard immunetiketten er en lavere følsomhet enn isotopiske prober. Likevel reduseres det ved kobling av polymerasekjedereaksjon (PCR) og dot-blot-analyser. Denne tilnærmingen muliggjør berikelse av målsekvensen og dens deteksjon. I tillegg kan den brukes som en kvantitativ applikasjon sammenlignet med en seriell fortynning av en velkjent standard. En dot-blot-applikasjon for å oppdage Leptospira fra de tre hovedkladene i vannprøver presenteres her. Denne metoden kan brukes på store mengder vann når de har blitt konsentrert ved sentrifugering for å gi bevis på tilstedeværelsen av leptospiralt DNA. Dette er et verdifullt og tilfredsstillende verktøy for generelle screeningformål, og kan brukes til andre ikke-dyrkbare bakterier som kan være tilstede i vann, noe som øker forståelsen av økosystemet.

Introduction

Leptospirose hos mennesker stammer hovedsakelig fra miljøkilder 1,2. Tilstedeværelsen av Leptospira i innsjøer, elver og bekker er en indikator på leptospiroseoverføring blant dyreliv og husdyr og produksjonsdyr som til slutt kan komme i kontakt med disse vannmassene 1,3,4. Videre har Leptospira blitt identifisert i ikke-naturlige kilder, inkludert kloakk, stillestående og vann fra springen 5,6.

Leptospira er en verdensomspennende distribuert bakterie 7,8, og miljøets rolle i bevaring og overføring har blitt godt anerkjent. Leptospira kan overleve i drikkevann under variabel pH og mineraler9, og i naturlige vannmasser1. Den kan også overleve i lange perioder i destillert vann10, og under konstant pH (7,8) kan den overleve opptil 152 dager11. Videre kan Leptospira samhandle i bakterielle konsortier for å overleve tøffe forhold12,13. Det kan være en del av biofilm i ferskvann med Azospirillum og Sphingomonas og er til og med i stand til å vokse og tåle temperaturer over 49 ° C14,15. Det kan også formere seg i vannmettet jord og forbli levedyktig i opptil 379 dager16, og bevare sin evne til å forårsake sykdommen så lenge som et år17,18. Imidlertid er lite kjent om økologien i vannlegemer og hvordan den er fordelt i dem.

Siden oppdagelsen var studien av slekten Leptospira basert på serologiske tester. Det var ikke før det nåværende århundre at molekylære teknikker ble mer utbredt i studiet av denne spirochaete. Dot-blot har knapt blitt brukt til identifikasjon ved hjelp av (1) en isotopisk sonde basert på 16S rRNA og på en inter-enkel sekvensrepetisjon (ISSR) 19,20, (2) som en nanogoldbasert immunoassay for human leptospirose anvendt på urin21, eller (3) som en antistoffbasert analyse for storfe urinprøver22. Teknikken falt ut av bruk fordi den opprinnelig var basert på isotopiske prober. Det er imidlertid en velkjent teknikk som, kombinert med PCR, gir forbedrede resultater, og det anses som trygt på grunn av bruk av ikke-isotopiske prober. PCR spiller en avgjørende rolle i anrikningen av Leptospira DNA ved å amplifisere et spesifikt DNA-fragment som kan finnes i spormengder i en prøve. Under hver PCR-syklus dobles mengden av det målrettede DNA-fragmentet i reaksjonen. På slutten av reaksjonen har amplikonen blitt multiplisert med en faktor på mer enn en million23. Produktet forsterket av PCR, ofte ikke synlig i agaroseelektroforese, blir synlig gjennom spesifikk hybridisering med en DIG-merket sonde i dot-blot 24,25,26.

Dot-blot-teknikken er enkel, robust og egnet for mange prøver, noe som gjør den tilgjengelig for laboratorier med begrensede ressurser. Det har blitt brukt i en rekke bakteriestudier, inkludert (1) orale bakterier27, (2) andre prøvetyper som mat og avføring28, og (3) identifisering av unculturable bakterier29, ofte i samsvar med andre molekylære teknikker. Blant fordelene som tilbys av dot-blot-teknikken er: (1) Membranen har en høy bindingskapasitet, i stand til å binde over 200 μg / cm2 nukleinsyrer og opptil 400 μg / cm2; (2) Dot-blot-resultater kan tolkes visuelt uten å kreve spesialutstyr, og (3) de kan enkelt lagres i årevis ved romtemperatur (RT).

Slekten Leptospira har blitt klassifisert i patogene, mellomliggende og saprofytiske klader30,31. Skillet mellom disse kladene kan oppnås basert på spesifikke gener som lipL41, lipL32 og 16S rRNA. LipL32 er tilstede i de patogene kladene og utviser høy sensitivitet i ulike serologiske og molekylære verktøy, mens den er fraværende i saprofyttarter21. Housekeeping-genet lipL41 er kjent for sitt stabile uttrykk og brukes i molekylære teknikker32, mens 16S rRNA-genet brukes til klassifisering.

Denne metoden kan brukes på store mengder vann når de har blitt konsentrert ved sentrifugering. Det tillater vurdering av ulike punkter og dybder i en vannkropp for å oppdage tilstedeværelsen av leptospiralt DNA og kladen som den tilhører. Dette verktøyet er verdifullt for både økologiske og generelle screeningformål, og kan også brukes til å oppdage andre ikke-dyrkbare bakterier som kan være tilstede i vann.

I tillegg er PCR- og dot-blot-analyser teknisk og økonomisk rimelige for et bredt spekter av laboratorier, selv de som mangler sofistikert eller dyrt utstyr. Denne studien tar sikte på å anvende digoksigeninbasert dot-blot for identifisering av de tre Leptospira-klader i vannprøver samlet fra naturlige vannmasser.

Bakterielle stammer
Tolv Leptospira serovarer (Autumnalis, Bataviae, Bratislava, Canicola, Celledoni, Grippothyphosa, Hardjoprajitno, Icterohaemorrhagiae, Pomona, Pyrogenes, Tarassovi, og Wolffi) ble inkludert i denne studien. Disse serovarene er en del av samlingen ved Institutt for mikrobiologi og immunologi, Fakultet for veterinærmedisin og zooteknikk, National Autonomous University of Mexico, og de brukes for tiden i mikroagglutineringstesten (LAR).

Alle Leptospira serovarer ble dyrket i EMJH, og deres DNA ble ekstrahert ved hjelp av et kommersielt DNA-ekstraksjonssett (se materialtabell). En genomisk DNA-blanding av de tolv serovarene ble brukt som en positiv kontroll for den patogene kladen Leptospira . Som positiv kontroll av mellomkladen Leptospira ble genomisk DNA fra Leptospira fainei serovar Hurstbridge-stamme BUT6 inkludert, og som positiv kontroll for Leptospira-saprofyttkladen ble også genomisk DNA fra Leptospira biflexa serovar Patoc-stammen Patoc I, inkludert.

Negative kontroller besto av et tomt plasmid, DNA fra ikke-relaterte bakterier (Ureaplasma urealyticum, Staphylococcus aureus, Brucella abortus, Salmonella typhimurium, Shigella boydii, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii og Escherichia coli) og PCR-gradig vann, som fungerte som ikke-malkontroll.

Vannprøver
Tolv prøvetakingsprøver ble samlet inn ved hjelp av en stratifisert-tilfeldig prøvetakingsmetode fra Cuemanco Biological and Aquaculture Research Center (CIBAC) (19° 16' 54" N 99° 6' 11" W). Disse prøvene ble tatt på tre dybder: overfladisk, 10 og 30 cm (figur 1A, B). Vanninnsamlingsprosedyrene påvirket ingen truede eller beskyttede arter. Hver prøve ble samlet i et sterilt 15 ml mikrosentrifugerør. For å samle prøven ble hvert rør forsiktig nedsenket i vannet, fylt på den valgte dybden og deretter forseglet. Prøvene ble oppbevart ved 22 °C og straks transportert til laboratoriet for behandling.

Hver prøve ble konsentrert ved sentrifugering i sterile 1,5 ml mikrosentrifugerør ved 8000 x g i 20 minutter ved romtemperatur. Dette trinnet ble gjentatt til alle prøvene ble konsentrert i ett rør, som deretter ble brukt til DNA-ekstraksjon (figur 1C).

Figure 1
Figur 1: Konsentrasjon av vannprøver ved sentrifugering. (A) Vannprøvedammer, og (B) Naturlige bekker. (C) Sentrifugeringsbasert vannprøvebehandling i gjentatte trinn så mange ganger som nødvendig (n). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

DNA-ekstraksjon
Totalt DNA ble isolert ved hjelp av et kommersielt genomisk DNA-sett i henhold til produsentens instruksjoner (se materialtabell). DNA-ekstraksjoner ble eluert i 20 μL elueringsbuffer, og DNA-konsentrasjon ble bestemt av et UV-spektrofotometer ved 260-280 nm, og lagret ved 4 °C til bruk.

PCR-amplifikasjon
PCR-målene var 16S rRNA-, lipL41- og lipL32-gener, som identifiserer DNA fra slekten Leptospira og tillater skillet mellom de tre kladene: patogen, saprofytisk og mellomliggende. Både primere og sondedesign var basert på tidligere arbeider av Ahmed et al., Azali et al., Bourhy et al., Weiss et al. og Branger et al.33,34,35,36,37. Sekvensen av hver sonde, primer og forsterkede fragment er beskrevet i tabell 1, og deres tilpasning til referansesekvenser er gitt i tilleggsfil 1, tilleggsfil 2, tilleggsfil 3, tilleggsfil 4 og tilleggsfil 5. PCR-reagensene og termosyklusforholdene er beskrevet i protokollavsnittet.

Forsterkningsprodukter ble visualisert ved elektroforetisk separasjon på en 1% agarosegel i TAE (40 mM Tris-base, 20 mM eddiksyre og 1 mM EDTA; pH 8,3), ved 60 V i 45 minutter med ethidiumbromiddeteksjon, som vist i tilleggsfigur 1. Genomisk DNA oppnådd fra hver serovar ble brukt med konsentrasjoner fra 6 x 106 til 1 x 104 genomiske ekvivalente kopier (GEq) i hver PCR-reaksjon, basert på genomstørrelsen til L. interrogans (4, 691, 184 bp) 38 for patogen Leptospira, genomstørrelsen til L. biflexa (3, 956, 088 bp) 39 for saprofytisk Leptospira, og genomstørrelsen til L. fainei serovar Hurstbridge-stamme BUT6 (4, 267, 324 bp) med tiltredelsesnummer AKWZ00000000.2.

Sensitiviteten til sondene ble vurdert med DNA fra hver patogen serovar, L. biflexa serovar Patoc stamme Patoc I og L. fainei serovar Hurstbridge stamme BUT6 i hvert eksperiment. For å vurdere spesifisiteten til PCR- og dot-blot-hybridiseringsanalysen ble DNA fra ikke-relaterte bakterier inkludert.

Tabell 1: PCR-primere og prober for å amplifisere produkter for å identifisere de patogene, saprofyte og mellomliggende klader av Leptospira. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Dot-blot hybridiseringsanalyse
Teknikken kalles dot-blot fordi hullene der DNA-prøven er plassert har en prikkform, og når de suges for å festes på plass ved vakuumsuging, får de denne formen. Denne teknikken ble utviklet av Kafatos et al.40. Teknikken tillater semi-kvantifisering av Leptospira i hver PCR-positiv prøve. Protokollen består av en denaturering med NaOH 0,4 M ved romtemperatur, prøver med Leptospira DNA fra 30 ng til 0,05 ng, tilsvarende 6 x 106 til 1 x 104 leptospirer, blir blottet på en nylonmembran med et 96-brønns dot-blot-apparat. Etter immobilisering er DNA bundet til membranen ved eksponering for 120 mJ UV-lys. Hver DNA-sonde er konjugert med digoksigenin-11 dUTP ved et terminalt transferasekatalysetrinn i 3'-enden (Digoxigenin er et plantesteroid oppnådd fra Digitalis purpurea, brukt som reporter41). Etter den strenge hybridiseringen av den merkede DNA-sonden (50 pmol) ved den spesifikke temperaturen på mål-DNA, visualiseres DNA-hybridene ved kjemiluminescensreaksjonen med det alkaliske fosfataseantistoffet mot digoksigenin kovalent konjugert med dets substrat CSPD. Luminescensen fanges opp ved eksponering for røntgenfilm (figur 2).

Figure 2
Figur 2: Trinn i prosedyren for PCR-dot-blot-analysen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forberedelse av prøver

  1. Konsentrer hver vannprøve i 1,5 ml mikrosentrifugerør ved sentrifugering ved 8000 x g i 10 minutter ved 4 °C. Gjenta dette trinnet, så mange ganger som nødvendig, for å konsentrere prøven til et volum på 250 μL.
  2. Bruk DNA-ekstraksjonssettet i henhold til produsentens instruksjoner (se materialtabell).
  3. Utfør den spesifikke PCR i henhold til dot-blot-sonden som skal brukes (tabell 1).
    1. Utfør amplifikasjonene i PCR-rør med det endelige volumet på 25 μL inneholdende 1 X buffer, 2,5 enheter Taq-polymerase, 1 μM av hver primer, 0,2 mM av hver dNTP, 1,5 mM MgCl2 og 100 ng mål-DNA fra hver vannprøve eller referansegenomisk DNA.
    2. Programmer PCR-reaksjonen i en termosyklist i henhold til termocyklingsforholdene (tabell 2).
    3. Oppbevar reaksjonene ved 4 °C inntil bruk.
  4. Plasser 10 μL av hvert PCR-produkt som skal blottes i en separat brønn på en 96-brønnsplate.
  5. Tilsett 40 μL TE til hver brønn og bland ved pipettering.
    MERK: Platen med 96 brønner kan forsegles og oppbevares ved 4 °C over natten. Følg instruksjonene i tilleggsfil 6 for å klargjøre buffere og løsninger for protokollen. Figur 3 viser trinnene for prøvepreparering.

Tabell 2: PCR-termosyklusbetingelser for 16S-, lipL41- og lipL32-genene. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Figure 3
Figur 3: PCR og prøvepreparering. Ved bruk av den spesifikke PCR-protokollen ble PCR-produktet overført til en mikrotiterplate, og 40 μL TE ble tilsatt til hver brønn. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

2. Montering av dot-blot-apparatet

MERK: Monteringen av dot-blot-apparatet er vist i figur 4. Under prosedyren, bruk hansker for å håndtere alkaliløsningene og beskytte nylonmembranen mot forurensning.

Figure 4
Figur 4: Prikk-blot-apparatmontering. Filterpapiret og nylonmembranen (tidligere fuktet i 10 X SSPE) må ordnes i riktig rekkefølge. Monteringen må festes med skruene tett før vakuumet påføres. Hver brønn må vaskes med TE, og PCR-produktene lastes inn i sine respektive brønner. Etter overføring av PCR-produktet gjennom membranen, vaskes hver brønn igjen med TE og får tørke. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Klipp nylonmembranen (se Materialfortegnelse) og filtrer papir i ark med størrelse 12 x 8,5 cm.
  2. Merk membranen med en permanent markør.
  3. Lag et hakk med saks i den ene kanten for å indikere riktig retning. Bruk merket til å huske prøverekkefølgen.
  4. Fukt membranen og filterpapiret med 10 X saltvann-natriumfosfat-EDTA-buffer (SSPE; 3 M NaCl, 0,2 M NaH2PO4 og 0,02 M EDTA, pH 7,4) (tilleggsfil 6). Håndter membranen med en ren, butt pinsett.
  5. Monter prikk-blot-kammeret; Først filterpapiret, etterfulgt av membranen over plastforseglingen. Fest dekselet med skruene på tvers.
  6. Koble kammeret til vakuumet, plasser 100 μL TE i hver brønn, hold vakuumet i 1 min, og stopp det deretter.
  7. Slå på vakuumet ved lav hastighet og last 50 μL av hver prøve inn i den tilsvarende brønnen på membranen til dot-blot-apparatet (etter den forhåndsbestemte membranfordelingen).
    MERK: Homogeniser hver prøve i hemagglutinering 96 brønnplaten før du plasserer den i dot-blot-kammeret.
  8. La vakuumet tørke membranen. Om nødvendig, slå kammeret forsiktig for å frigjøre boblene i prøven.
  9. Vask hver brønn ved å plassere 100 μL TE i den med et kontinuerlig vakuum og la den tørke.
    MERK: Etter å ha fullført overføringen, er det avgjørende å først slå av pumpen og koble den fra. Unnlatelse av å gjøre dette kan føre til tilbakeløp som kommer inn i apparatet. DNA trenger ikke et denatureringstrinn hvis en positivt ladet nylonmembran brukes, men hvis du bruker annen inert støtte, kan det være nødvendig med et pre-denatureringstrinn og alkalibasert denaturering41.

3. DNA-denaturering og fiksering

MERK: Figur 5 illustrerer DNA-membranfikseringsprosedyren.

Figure 5
Figur 5: DNA-membranfikseringsprosedyre. DNA denatureres i en alkalisk løsning. Deretter nøytraliseres den med 10 X SSPE, og membranen tørkes. Deretter blir membranen transilluminert. Membranen rehydreres med 2 X SSPE og prehybridiseres over natten. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Inkuber membranen med 0,4 M NaOH i 10 minutter ved romtemperatur.
  2. Balansere membranen med 10 X SSPE i 10 minutter ved romtemperatur.
  3. Tørk membranen ved 80 °C i 2 timer.
  4. Transilluminer med 120 mJ UV-lys i 3 min. Sørg for at prøvene er orientert med forsiden ned mot UV-lyskilden. Hvis du bruker en UV-kryssbinder, må du bekrefte at prøvene vender oppover og gjenta dette trinnet to ganger.
    MERK: Membranen må være helt tørr før UV-tverrbinding. DNA vil bli immobilisert av en kovalent binding til nylonmembranen. Hver tverrbinding tar omtrent 18'' til 1' med en optimal UV-bestrålingsdose, for de fleste hybridiseringseksperimenter, på ca. 0,6-0,8 kJ/m2.
    Eksponering for UV-bestråling er skadelig for øyne og hud. Bruk egnet verneutstyr og unngå eksponering for bar hud.
  5. Vask membranen med 2 X SSPE i 10 min.
  6. Brett membranen forsiktig og sett den inn i hybridiseringsrøret (bruk et 15 ml mikrosentrifugerør).
  7. Tilsett 10 ml av prehybridiseringsløsningen (tilleggsfil 6) til røret og inkuber ved 42 °C over natten. Forsikre deg om at røret er ordentlig forseglet for å forhindre lekkasje.

4. Hybridisering

  1. Fjern 5 ml av prehybridiseringsløsningen fra hybridiseringsrøret. For å bruke 5 ml for andre gang, oppbevar den i en annen tube og oppbevar den ved -4 °C.
  2. Tilsett 15 μL av den merkede sonden (tabell 1) til hybridiseringsrøret. Skyll spissen inn i oppløsningen for å sikre at den merkede sonden ble grundig dryppet inn i fortynningen.
    MERK: DNA-sondens binding er ikke så sterk som antigen-antistoffbindingen. Derfor kan endringer i konsentrasjonen av sonden eller DNA i prøven påvirke intensiteten av den utstrålede fluorescensen. DNA-prober er støkiometriske, noe som betyr at antall sondemolekyler bundet til DNA tilsvarer antall DNA-molekyler som er tilstede i løsningen. Figur 6 viser sondehybridiseringen.
  3. Inkuber ved 42 °C over natten.
  4. Utfør DNA-sonde DIG-merking. Følg instruksjonene angitt i tabell 3 for å blande reagensene, og inkuber deretter blandingen ved 37 °C i 1 time. Tilsett deretter 80 μL destillert vann og oppbevar den tailed sonden ved 4 ° C.

Figure 6
Figur 6: Sondehybridisering. Volumet av hybridiseringsbufferen justeres, og den digoksigeninmerkede sonden er innlemmet for å tillate sondens hybridisering over natten. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 3: Reagenser for sondemerking med digoksigenin (DIG). Klikk her for å laste ned denne tabellen.

5. Kjemiluminescens (anti-DIG-merking)

  1. Vask membranen to ganger med 2 X SSPE/0,1 % SDS ved romtemperatur i 10 min.
  2. Inkuber membranen med 5 X SSPE/0,1 % SDS ved sondens glødetemperatur i 15 min.
    MERK: I dette trinnet bruker du en beholder med lokk for å opprettholde temperaturen så lenge som mulig. Sørg for jevn og konstant temperatur over membranen. Det omtrentlige volumet i hver vask er 100 ml av den angitte oppløsningen.
  3. Vask membranen én gang med buffer 1 (tilleggsfil 6) i romtemperatur i 5 minutter.
  4. Vask membranen én gang med buffer 2 (tilleggsfil 6) ved romtemperatur i 30 min.
  5. Vask membranen med buffer 2 og tilsett anti-digoksigeninantistoffet (15 μL) (se materialtabellen), inkuber deretter i 45 minutter (inkubasjonstiden kan variere fra 30-60 min). Dette sekundære antistoffet merker sonden for deteksjon.
    MERK: Membranen kan oppbevares i buffer 2 med antidigoksigeninantistoffet over natten ved 4-8 °C. Anti-DIG-merking av kjemiluminescensprosessen er vist i figur 7.

Figure 7
Figur 7: Anti-DIG-merking av kjemiluminescensprosessen. De ubundne nukleinsyrene fjernes med bufferløsninger. Sonden er justert med mål-DNA, og overskuddet fjernes. Membranen er blokkert med den blokkerende 1 X bufferen, og anti-DIG-antistoffet tilsettes (1:10000). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

6. Kjemiluminescens (substratapplikasjon)

  1. Vask membranen to ganger i buffer 1 ved romtemperatur i 15 minutter.
  2. Vask en gang i buffer 3 (se tilleggsfil 6) ved romtemperatur i 5 minutter, slik at membranen kan tømme det meste av bufferen, slik at den nesten tørker.
  3. Tilsett CSPD klar til bruk (Dinatrium 3-(4-metoksyspiro {1,2-dioksetan-3,2′-(5'-klor) trisyklo [3.3.1.13,7] dekan}-4-yl) fenylfosfat, se materialfortegnelse), og la den forbli i 5 min, (med dempede fingre homogeniserer CSPD fra den ene siden til den andre).
  4. Plasser membranen i en gjennomsiktig plastpose (12,5 x 9 cm) som passer membrandimensjonen. Fjern forsiktig luftbobler, fordel CSPD jevnt og forsegl posen.
  5. Inkuber membranen i et vannbad ved 37 °C i 15 minutter (den kan være opptil 30 min), og sørg for at membranen med prøver plasseres nedover slik at den er godt nedsenket. Sørg for at temperaturen forblir konstant og godt fordelt over membranen.
  6. Tørk plastposen og fest den med skrapebånd på en allerede brukt radiografisk film. Dette vil tillate enkel håndtering under eksponeringsprosedyren.
    MERK: Figur 8 viser substratpåføringen av kjemiluminescensprosessen.

Figure 8
Figur 8: Substratpåføring av kjemiluminescensprosessen. Det frie antistoffet fjernes, og substratet CSPD (1:250) tilsettes membranen. Reaksjonen aktiveres ved inkubasjon ved 37 °C, og membranen er anordnet for å registrere kjemiluminescensen i en røntgenfilm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

7. Kjemiluminescens (deteksjon)

  1. Utfør eksponeringsprosedyren. I mørkerommet, klargjør utvikler- og fikserløsningene (se materialfortegnelse) i de respektive skuffene.
  2. I mørket plasserer du den faste membranen forsiktig mot en ny radiografisk film og setter den inn i en radiografisk kassett (se materialfortegnelse).
  3. Registrer eksponeringstidspunktet. Eksponeringstiden kan variere fra 1 min til 30 min eller mer. Start med 5 min og juster tiden deretter.
  4. Fukt røntgenfilmen i 1-3 min og skyll forsiktig med vann fra springen (15-45 s).
  5. Fukt røntgenfilmen i fikserløsning i 1-3 min og skyll forsiktig med vann fra springen (45 s).
  6. La røntgenfilmen lufttørke og dokumenter analysen i en synlig hvit lysboks.
    MERK: Unngå å riste membranen under røntgeneksponeringstiden. Deteksjonsprosessen er avbildet i figur 9.
  7. Gå videre til resultattolkningen. I den eksponerte røntgenfilmen kan prikkene med utslipp være visuelt plassert og korrespondere med DNA-fragmentene med sondens hybridisering. Intensiteten til det utstrålede signalet avhenger av luminescensen og varigheten av eksponeringen.
    MERK: Membraner kan oppbevares tørket mellom filterpapir i flere måneder ved romtemperatur.

Figure 9
Figur 9: Påvisning av kjemiluminescensprosessen. Under mørke forhold blir membranen utsatt for en røntgenfilm inne i en røntgenkassett. Deretter fikk den stå under utstillingstiden, og deretter ble røntgenfilmen utviklet og festet. Til slutt ble det lufttørket og tolket. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

8. Prosedyre for dehybridisering av membran

  1. Vask membranen to ganger i 10 min med destillert vann.
  2. Vask membranen i 20 min med 0,4 M NaOH ved 53 °C (to ganger).
  3. Vask to ganger membranen i 10 min med 2 x SSPE.
  4. La membranen tørke ved romtemperatur.
  5. Behold membranen og gå tilbake til trinn 3.5 i protokollen.
    MERK: Membranen kan lagres i prehybridiseringsbufferen over natten ved 4-8 °C. Neste dag, start på nytt med en inkubasjon ved 42 ° C i 1 time, slik at prehybridiseringsbufferen når temperaturen. Fortsett deretter til trinn 3.5 i protokollen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å vurdere effektiviteten av teknikken ble genomisk DNA fra rene kulturer av hver Leptospira serovar brukt, sammen med den kladespesifikke sonden. Membraner ble fremstilt med 100 ng genomisk DNA per PCR-reaksjon for hver serovar, etterfulgt av åtte genomiske DNA av ikke-relaterte bakterier og variable konsentrasjoner av genomisk DNA av ad hoc Leptospira serovarer. Hver analyse inkluderte positiv, negativ og ikke-malkontroll. Disse ikke-relaterte genomiske DNA-ene viste ikke en affinitet for dot-blot-probene. Membranfordeling og prikkblotmembraner er vist i tilleggsfigur 2, tilleggsfigur 3, tilleggsfigur 4, tilleggsfigur 5, tilleggsfigur 6, tilleggsfigur 7. Når det gjelder saprofyttkladen, ved bruk av DB_Saproprobe med PCR-produktet på 1059 bp forsterket med primere DB_16SPathoREV og DB_16SPathoFWD, og PCR-produktet på 517 bp forsterket med primere DB_16SSapREV og DB_16SSapFWD med genomisk DNA av Leptospira biflexa serovar Patoc stamme Patoc I, Det var mulig å påvise mellom 0,05-0,1 ng saprofytt-DNA (tilleggsfigur 2 og tilleggsfigur 3). På samme måte, for påvisning av mellomkladen, ved bruk av DB_Interprobe med PCR-produktet på 1059 bp forsterket med primere DB_16SPathoREV og DB_16SPathoFWD, og PCR-produktet på 299-301 bp forsterket med primerne DB_16SInterREV og DB_16SInterFWD med genomisk DNA av Leptospira fainei serovar Hurstbridge-stamme BUT6 (tilleggsfigur 4 og tilleggsfigur 5), var det mulig å oppdage rundt 0,1 ng av mellomliggende DNA. Tilsvarende, for den patogene kladen som bruker DB_16SPathoprobe med PCR-produktet på 1059 bp forsterket av primere DB_16SPathoREV og DB_16SPathoFWD, eller DBlipL41probe med PCR-produktet på 479 bp forsterket av primere DB_lipL41REV og DB_lipL41FWD med genomisk DNA-blanding fra patogene Leptospira serovarer, Det var mulig å påvise DNA-konsentrasjoner på 0,3-0,6 ng patogent DNA (tilleggsfigur 6 og tilleggsfigur 7).

Analysene som er utformet for å identifisere de tre kladene, kan brukes individuelt for hver klade. Når det gjelder verdifulle og knappe prøver, kan imidlertid en enkelt membran fremstilles med primere DB_16SPathoREV ogDB_16 SPathoFWD, som forsterker et 1058-1069 bp-produkt. Dette produktet kan deretter hybridiseres med DB_Interprobe, DB_Saproprobe og DB_16SPathoprobe individuelt, med dehybridiseringstrinnet (trinn 8) før hver av dem. Denne tilnærmingen gjør det mulig å identifisere alle klader i samme membran.

I feltvannprøvene ble lipL32-sondeprotokollen anvendt. Hver vannprøves DNA ble brukt i en konsentrasjon på 100 ng per PCR-reaksjon. I tillegg ble en DNA-ekstraksjonsprotokollkontroll inkludert, som besto av å spike 100 ng Leptospira-genomisk DNA inn i en 15 ml destillert vannprøve. Negative og positive kontroller ble også inkludert (figur 10).

Tabell 4: Beskrivelse og dybde av vannprøver. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Figure 10
Figur 10: Dot-blot-analyse av hver vannprøve. (A) Membranfordeling og (B) prikk-blot av DB_lipL32probe og produktet (262 bp) av primere DB_lipL32REV og DB_lipL32FWD av feltvannprøvene. Overflaten på dam 3 viser et positivt resultat, og både ekstraksjonsprotokollkontrollen og de positive kontrollene har et intenst signal. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Vannprøvebeskrivelsen er vist i tabell 4, og prikkflekkmembranfordeling og bilde er vist i figur 9. Prikken A7 viser at leptospiralt DNA var tilstede på overflaten av dam 3. For å bestemme DNA-konsentrasjonen som var tilstede i dam 3, ble det utført en dot-blot-analyse med kjente DNA-konsentrasjoner av en blanding av Leptospira serovarer og lipL32-sonden (figur 11). Membranen ble fremstilt med genomisk DNA fordelt fra 100 ng til 1 x 10-13 ng i hver prikk. Minimumskonsentrasjonen som utvilsomt kan påvises var ca. 0,3 ng, tilsvarende 6 x 105 GEq i vannprøvene.

Figure 11
Figur 11: Dot-blot-analyse med kjente DNA-konsentrasjoner av en blanding av Leptospira serovarer og lipL32-sonden. (A) Membranfordeling og (B) dot-blot av DB_lipL32probe og produktet (262 bp) av primere DB_lipL32REV og DB_lipL32FWD med fortynninger (1:2) av en genomisk DNA-blanding av patogene Leptospira serovarer. Sondens signal kan lett detekteres ned til 3,91 x 10-1 ng Leptospira DNA-blanding. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfigur 1: PCR-amplifikasjonsprodukter visualisert ved elektroforetisk separasjon. Felt 1. Molekylvektmarkør 100 bp DNA-stige. Bane 2. PCR basert på lipL32-genet med patogen Leptospira DNA-blanding som mal; Felt 3. PCR basert på lipL41-genet med patogen Leptospira DNA-blanding som mal; Felt 4. PCR basert på 16S rRNA-genet med patogen Leptospira DNA-blanding som mal; Felt 5. PCR basert på 16S rRNA-genet med primere DB_16SSapREV og DB_16SSapFWD, og Leptospira biflexa serovar Patoc stamme Patoc I DNA som mal; Felt 6. PCR basert på 16S rRNA-genet med primere DB_16SPathoREV og DB_16SPathoFWD, og Leptospira biflexa serovar Patoc stamme Patoc I DNA som mal; Felt 7. PCR basert på 16S rRNA-genet med primere DB_16SInterREV og DB_16SInterFWD, og Leptospira fainei, serovar Hurstbridge-stamme BUT6 DNA som mal; Felt 8. PCR basert på 16S rRNA-genet med primere DB_16SPathoREV og DB_16SPathoFWD, og Leptospira fainei, serovar Hurstbridge-stamme BUT6 DNA som mal. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 2: (A) Membranfordeling og (B) prikk-blot av DB_Saproprobe og produktet (1059 bp) av primere DB_16SPathoREV og DB_16SPathoFWD av genomisk DNA av Leptospira biflexa serovar Patoc, Patoc I. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 3: (A) Membranfordeling og (B) prikkflekk av DB_Saproprobe med produktet (517 bp) av primere DB_16SSapREV og DB_16SSapFWD av genomisk DNA av Leptospira biflexa serovar Patoc, Patoc I. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 4: (A) Membranfordeling og (B) dot-blot av DB_Interprobe med produktet (1059 bp) av primere DB_16SPathoREV og DB_16SPathoFWD og genomisk DNA av Leptospira fainei serovar Hurstbridge-stamme BUT6. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 5: (A) Membranfordeling og B) dot-blot av DB_Interprobe og produktet (299-301 bp) av primere DB_16SInterREV og DB_16SInterFWD med genomisk DNA av Leptospira fainei serovar Hurstbridge-stamme BUT6. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 6: (A) Membranfordeling og (B) dot-blot av DB_16SPathoprobe og produktet (1059 bp) av primere DB_16SPathoREV og DB_16SPathoFWD med genomisk DNA-blanding av patogene Leptospira serovarer. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfigur 7: (A) Membranfordeling og (B) prikk-blot av DB_lipL41probe med produktet (479 bp) av primere DB_lipL41REV og DB_lipL41FWD med genomisk DNA-blanding av patogene Leptospira serovarer. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 1: Justering av saprofytt Leptospira-arter med primere og sonde basert på 16S ribosomal RNA-sekvens. Primere er uthevet i fet skrift og svart for identifikasjon, med retningen indikert med svarte piler. Sonden er markert med fet skrift og uthevet i grått, og posisjonen er markert med en grå linje. De justerte sekvensene er uthevet i lys grå, mens de ikke-tilsvarende sekvensene er i svart-hvitt. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 2: Justering av mellomliggende Leptospira-arter med primere og sonde basert på 16S ribosomal RNA-sekvens. Primere er uthevet i fet skrift og svart for identifikasjon, med retningen indikert med svarte piler. Sonden er markert med fet skrift og uthevet i grått, og posisjonen er markert med en grå linje. De justerte sekvensene er i lysegrå, mens de ikke-tilsvarende sekvensene vises i svart-hvitt. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 3: Justering av patogene Leptospira-arter med primere og sonde basert på lipL32-gensekvensen. Primere er uthevet i fet skrift og svart for identifikasjon, med retningen indikert med svarte piler. Sonden er markert med fet skrift og uthevet i grått, og posisjonen er markert med en grå linje. De justerte sekvensene er i lysegrå, mens de ikke-tilsvarende sekvensene vises i svart-hvitt. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 4: Justering av patogene Leptospira-arter med primere og sonde basert på lipL41-gensekvensen. For deres identifikasjon er primere i fet skrift og uthevet i svart, med retningen indikert med svarte piler. Sonden er markert med fet skrift og uthevet i mørkegrå, og posisjonen er markert med en grå linje. De justerte sekvensene er i lys grå, mens de ikke-tilsvarende sekvensene er i svart-hvitt. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 5: Justering av Leptospira-arter med primere rettet mot 16S ribosomal RNA-sekvens og sonder for saprofytt, mellomliggende og patogene arter. For identifikasjon er primere angitt med fet skrift og uthevet i svart, med retningen merket med svarte piler. Probene er angitt med fet skrift og uthevet i grått, med deres posisjoner representert med grå linjer. De justerte sekvensene er i lysegrå, og de ikke-tilsvarende sekvensene er i hvitt og svart. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 6: Buffere og løsninger for dot-blot-analysen. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De kritiske trinnene i dot-blot-teknikken inkluderer (1) DNA-immobilisering, (2) blokkering av de frie bindingsstedene på membranen med ikke-homologt DNA, (3) komplementariteten mellom sonden og målfragmentet under glødningsbetingelser, (4) fjerning av den uhybridiserte sonden og (5) påvisning av reportermolekylet41.

PCR-Dot-blot har visse begrensninger, for eksempel at teknikken ikke gir informasjon om størrelsen på det hybridiserte fragmentet37, det krever dehybridisering av en enkelt membran før rehybridisering med en andre eller tredje sonde, og det krever betydelig tid og krefter til sluttresultatet.

Denne teknikken har vist konsistens med andre molekylære teknikker42,43 og dens applikasjoner. Reverse dot-blot, nanogold dot-blot21 og dot-ELISA42 har blitt brukt til påvisning av spesifikke gener i organismer som Treponema44, Borrelia burgdorferi45, E. coli46, Helicobacter pylori47 og Mycobacterium tuberculosis48,49 basert på 16S rRNA29,43, og for påvisning av DNA eller RNA av plante virus41. Deteksjonsgrensen (LOD) definert som den laveste konsentrasjonen av mikroorganismen som kan måles konsekvent og pålitelig ved denne teknikken50, varierte fra 100 pg (5 x 104 bakterier) for H. pylori47, til en enkelt celle av B. burgdorferi i kliniske prøver45, og en fg, som er mindre enn en celle, av M. tuberkulose48,49.

Et verdifullt aspekt ved denne kombinerte metodikken er dens evne til å utvide deteksjonsgrensen med en ordre, overvinne falske negative resultater på grunn av to prøveforhold som kan føre til inkonsistente resultater: (1) prøver med utilstrekkelig DNA, eller (2) prøveforurensning, slik at 100% påvisning av positive prøver 25,45,47,48,49. PCR-Dot-blot har kapasitet til å oppdage lavere mengder forsterkede produkter enn de som kan detekteres i agarosegelelektroforese, og det unngår forurensning som følge av andre forsterkningstrinn, som i nestet og halvnestet PCR. Disse fordelene er spesielt kritiske når man arbeider med miljøprøver som inneholder en lav bakteriell ladning, som kan inneholde et bredere spekter av hemmere og DNA fra ikke-relaterte kilder som kan forstyrre molekylære teknikker.

Tidligere arbeid tyder på at leptospirer kan identifiseres ved DNA-prober merket med fotobiotin som når en LOD på 5 pg (5 x 103 leptospirer)51. DIG-merkede sonder oppdager 0,1-1 pg (102 leptospirer), mens 32P-merkede sonder oppdager 1-5 pg (750 til 1000 leptospirer)51, og biotinmerkede sonder oppdager 5 pg (2500 leptospirer)52. Videre nådde 32P-merkede sonder for saprofytt Leptospira en LOD på 1,95 ng og for patogen Leptospira, 3,9 ng53. I denne studien ble lignende LODer etablert for de tre kladene. LOD for sykdomsfremkallende arter var ca. 0,3 ng genomisk DNA (6-8 x 104 GEq) (figur 11), og for saprofytten og mellomarten var den nede i 0,1 ng (2 x 104 GEq). Spesielt ble tidligere undersøkelser utført ved bruk av rene Leptospira-kulturer 51 og sera fra eksperimentelt infiserte gyldne hamstere, med sikte på å oppdage patogen Leptospira54,55, og å anvende DNA-hybridisering med 32P merket som et verktøy for identifisering og klassifisering av Leptospira56. Disse probene viser høy spesifisitet og viser ikke krysshybridisering med ikke-homologt DNA fra andre mikroorganismer 19,51,54,55,56,57, og kan skille selv mellom nært beslektede arter som leptonema 57. På samme måte ble det i dette arbeidet ikke observert hybridisering med ikke-homologt DNA. Selv om ikke-isotopiske prober ikke er like følsomme som isotopprober58 eller andre teknikker43, kan det forventes at PCR-Dot-blot-kombinasjonen tillater opptil ti ganger økning i følsomhet sammenlignet med andre PCR-baserte teknikker, som sett ved påvisning av Leishmania og bovint herpesvirus 4 (BHV4) 24,26.

På den annen side har dot-blot-analysen for Leptospira-identifikasjon blitt hyppigere brukt med antistoffer, og i det siste med monoklonale antistoffer som et alternativ for å diagnostisere mennesker og dyr i urinprøver 59,60,61,62. I disse studiene behandles prøven direkte på membranen uten forutgående trinn, og antistoffer retter seg mot spesifikke Leptospira-overflateproteiner assosiert med patogenese. Mab-Dot-blot ELISA, for eksempel, viser høy følsomhet og spesifisitet, og oppdager så lite som 1 μg bakterielt homogenat62. Resultatene oppnådd fra Mab-Dot-blot-analysen kan sammenlignes med PCR-analyser, som vanligvis har LOD rundt 103 leptospirer / ml urin eller 9,3 ng Leptospira-homogenat 63. Mengden genomisk DNA som kan amplifiseres ved PCR er 100 celler (500 fg DNA)61. Disse tidligere studiene brukte rene kulturer eller kliniske prøver uten anrikningsprosedyrer og var orientert mot bedre diagnose. Gitt at infiserte rotter kan skille ut så mange som 107 leptospirer / ml urin64, og hunder kan skille ut mellom 102 til 106 leptospirer / ml urin65, som tjener som forurensningskilder for vannlegemer, krever miljøprøvene leptospiral anrikning. Den in vitro PCR-amplifiseringen av det målrettede DNA før blotting muliggjør en forbedring i prosedyrefølsomhet på opptil ti ganger52,55. Vanligvis vil produktet forsterket av en endepunkt-PCR ikke bli visualisert i en agarosegelelektroforese; Likevel blir det tydelig gjennom den spesifikke hybridiseringen av den DIG-merkede sonden i dot-blot.

Mens mye forskning på Leptospira og leptospirose har fokusert på sykdomsdiagnose, er lite kjent om deres økologi i vannlegemer og deres distribusjon i dem. PCR-Dot-blot-teknikken legger til verktøykassen for å studere Leptospira og leptospirose, og gir fordelen av screening av et stort antall prøver og fremskynde resultater og tolkning. PCR-Dot-blot er en relativt billig, enkel og ikke-radioaktiv teknikk som kan romme flere sonder på en enkelt membran. Dessuten eliminerer det behovet for sofistikert utstyr og komplekse arbeidsflyter, noe som kan være utfordrende i ressursbegrensede innstillinger.

Virkningen av denne studien ligger i sin fremtidige anvendelse for å studere store vannmasser på forskjellige dybder, samt andre økologiske nisjer og prøvetyper, inkludert jord, stillestående vann, avføring, blod og vev.

Avslutningsvis demonstrerer dette arbeidet anvendelsen av PCR-Dot-blot-teknikken, basert på digoksigeninmerking av DNA-prober for identifisering av de tre klader innen slekten Leptospira. Denne metoden strømlinjeformer identifikasjonsprosessen ved å redusere den til et enkelt forsterkningstrinn og tillater enten tre samtidige hybridiseringer eller tre påfølgende hybridiseringer ved bruk av en enkelt membran. Deteksjonsgrensene oppnådd med denne teknikken ligner de som oppnås med radioaktive sonder53, noe som gjør det til et verdifullt verktøy for å identifisere Leptospira i vannprøver fra naturlige kilder. Følgelig gir denne teknikken økt følsomhet og gir nøyaktige og konsistente resultater når man evaluerer prøver med minimale mengder bakterielt DNA. Det fungerer som en alternativ tilnærming for å studere dynamikken til Leptospira i vannforekomster og kan hjelpe til med vurdering og overvåking av bredere miljøprøver, som hjelper til med implementering av forebyggende tiltak mot overføring av denne mikroorganismen.

I tilfelle problemer med teknikken, bør du vurdere følgende feilsøkingshøydepunkter: (1) Hvis prikkene har uregelmessige former, må du kontrollere at vakuumsystemet er ordentlig lukket på tvers og deretter gjenta overføringen. (2) Hvis hybridiseringsrøret går i stykker under prosedyren over natten, noe som fører til at membranen mister hybridiseringsbufferen, se delen "De-hybridiseringsprosedyre" og start prosessen på nytt. (3) Hvis ingen prikker er synlige, må du ikke kaste membranen; Fortsett til delen "De-hybridiseringsprosedyre" for å gjenta hybridiseringstrinnene. (3) Hvis ujevne hvite områder blir lagt merke til på den utviklede røntgenfilmen, må du sørge for at ingen luftbobler fanges under poseforseglingsprosessen. (5) Hvis ujevne svarte områder observeres på den utviklede røntgenfilmen, må du bekrefte at CSPD er grundig fordelt ved hjelp av fuktede fingre. (6) Hvis røntgenfilmen viser skygger av prikkene, må du sørge for at filmen ikke flyttes i løpet av eksponeringstiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at det ikke foreligger noen interessekonflikt.

Acknowledgments

Vi står i gjeld til Leptospira-samlingen ved Institutt for mikrobiologi og immunologi, Fakultet for veterinærmedisin og zooteknikk, National Autonomous University of Mexico. Vi er takknemlige for den sjenerøse donasjonen av referansen Leptospira-stammer ; Leptospira fainei serovar Hurstbridge stamme BUT6 og Leptospira biflexa serovar Patoc stamme Patoc I til Dr. Alejandro de la Peña Moctezuma. Vi takker Dr. José Antonio Ocampo Cervantes, CIBAC-koordinator, og personellet for deres logistiske støtte. EDT var under Terminal Project-programmet for bachelorstudenter ved Metropolitan Autonomous University-Campus Cuajimalpa. Vi anerkjenner den Biorender.com programvaren for opprettelsen av figur 1 og 3 til 9.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Purelink DNA extraction kit Invitrogen K182002
Gotaq Flexi DNA Polimerase (End-Point PCR Taq polymerase kit) Promega M3001
Whatman filter paper, grade 1, Merk WHA1001325
Nylon Membranes, positively charged Roll 30cm x 3 m Roche 11417240001
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sheep Polyclonal Primary-antibody Roche 11093274910
Medium Base EMJH Difco S1368JAA
Leptospira Enrichment EMJH Difco BD 279510
Blocking Reagent Roche 11096176001
CSPD ready to use Disodium 3-(4-methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2′-(5′-chloro) tricyclo [3.3.1.13,7] decan}8-4-yl) phenyl phosphate Merk 11755633001
Deoxyribonucleic acid from herring sperm Sigma Aldrich D3159
Developer Carestream Carestream Health Inc GBX5158621
Digoxigenin-11-ddUTP Roche 11363905910
EDTA, Disodium Salt (Dihydrate) Promega H5032
Ficoll 400 Sigma Aldrich F8016
Fixer Carestream Carestream Health Inc GBX 5158605
Lauryl sulfate Sodium Salt (Sodium dodecyl sulfate; SDS) C12H2504SNa Sigma Aldrich L5750
N- Lauroylsarcosine sodium salt CH3(CH2)10CON(CH3) CH2COONa Sigma Aldrich L-9150 It is an anionic surfactant
Polivinylpyrrolidone (PVP-40) Sigma Aldrich PVP40
Polyethylene glycol Sorbitan monolaurate (Tween 20) Sigma Aldrich 9005-64-5
Sodium Chloride (NaCl) Sigma Aldrich 7647-14-5
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma Aldrich 151-21-3
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma Aldrich 1310-73-2
Sodium phosphate dibasic (NaH2PO4) Sigma-Aldrich 7558-79-4
Terminal transferase, recombinant Roche 3289869103
Tris hydrochloride (Tris HCl) Sigma-Aldrich 1185-53-1
SSPE 20X Sigma-Aldrich S2015-1L It can be Home-made following Supplementary File 6
Primers Sigma-Aldrich On demand Follow table 1
Probes Sigma-Aldrich On demand Follow table 1
Equipment
Nanodrop™ One Spectrophotometer Thermo-Scientific ND-ONE-W
Refrigerated microcentrifuge Sigma 1-14K, suitable for centrifugation of 1.5 ml microcentrifuge tubes at 14,000 rpm Sigma-Aldrich 1-14K
Disinfected adjustable pipettes, range 2-20 µl, 20-200 µl Gilson SKU:F167360
Disposable 1.5 ml microcentrifuge tubes (autoclaved) Axygen MCT-150-SP
Disposable 600 µl microcentrifuge tubes (autoclaved) Axygen 3208
Disposable Pipette tips 1-10 µl Axygen T-300
Disposable Pipette tips 1-200 µl Axygen TR-222-Y
Dot-Blot apparatus Bio-Dot BIORAD 1706545
Portable Hergom Suction Hergom 7E-A
Scientific Light Box (Visible-light PH90-115V) Hoefer PH90-115V
UV Crosslinker Hoefer UVC-500
Thermo Hybaid PCR Express Thermocycler Hybaid HBPX110
Radiographic cassette with IP Plate14 X 17 Fuji

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bierque, E., Thibeaux, R., Girault, D., Soupé-Gilbert, M. E., Goarant, C. A systematic review of Leptospira in water and soil environments. PLOS One. 15 (1), e0227055 (2020).
  2. Haake, D. A., Levett, P. N. Leptospirosis in humans. Current Topics in Microbiology and Immunology. 387, 65-97 (2015).
  3. Tripathy, D. N., Hanson, L. E. Leptospires from water sources at Dixon Springs Agricultural Center. Journal of Wildlife Diseases. 9 (3), 209-212 (1973).
  4. Smith, D. J., Self, H. R. Observations on the survival of Leptospira australis A in soil and water. The Journal of Hygiene. 53 (4), 436-444 (1955).
  5. Karpagam, K. B., Ganesh, B. Leptospirosis: a neglected tropical zoonotic infection of public health importance-an updated review. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases: Official Publication of the European Society of Clinical Microbiology. 39 (5), 835-846 (2020).
  6. Casanovas-Massana, A., et al. Spatial and temporal dynamics of pathogenic Leptospira in surface waters from the urban slum environment. Water Research. 130, 176-184 (2018).
  7. Costa, F., et al. Global morbidity and mortality of Leptospirosis: A systematic review. PLOS Neglected Tropical Diseases. 9 (9), e0003898 (2015).
  8. Mwachui, M. A., Crump, L., Hartskeerl, R., Zinsstag, J., Hattendorf, J. Environmental and behavioural determinants of Leptospirosis transmission: A systematic review. PLOS Neglected Tropical Diseases. 9 (9), e0003843 (2015).
  9. Andre-Fontaine, G., Aviat, F., Thorin, C. Waterborne Leptospirosis: Survival and preservation of the virulence of pathogenic Leptospira spp. in fresh water. Current Microbiology. 71 (1), 136-142 (2015).
  10. Trueba, G., Zapata, S., Madrid, K., Cullen, P., Haake, D. Cell aggregation: A mechanism of pathogenic Leptospira to survive in freshwater. International Microbiology: the Official Journal of the Spanish Society for Microbiology. 7 (1), 35-40 (2004).
  11. Smith, C. E., Turner, L. H. The effect of pH on the survival of leptospires in water. Bulletin of the World Health Organization. 24 (1), 35-43 (1961).
  12. Barragan, V. A., et al. Interactions of Leptospira with environmental bacteria from surface water. Current Microbiology. 62 (6), 1802-1806 (2011).
  13. Abdoelrachman, R. Comparative investigations into the influence of the presence of bacteria on the life of pathogenic and apathogenic leptospirae. Antonie van Leeuwenhoek. 13 (1), 21-32 (1947).
  14. Singh, R., et al. Microbial diversity of biofilms in dental unit water systems. Applied and Environmental Microbiology. 69 (6), 3412-3420 (2003).
  15. Kumar, K. V., Lall, C., Raj, R. V., Vedhagiri, K., Vijayachari, P. Coexistence and survival of pathogenic leptospires by formation of biofilm with Azospirillum. FEMS Microbiology Ecology. 91 (6), 051 (2015).
  16. Yanagihara, Y., et al. Leptospira Is an environmental bacterium that grows in waterlogged soil. Microbiology Spectrum. 10 (2), 0215721 (2022).
  17. Gillespie, R. W., Ryno, J. Epidemiology of leptospirosis. American Journal of Public Health and Nation’s Health. 53 (6), 950-955 (1963).
  18. Bierque, E., et al. Leptospira interrogans retains direct virulence after long starvation in water. Current Microbiology. 77 (10), 3035-3043 (2020).
  19. Zhang, Y., Dai, B. Marking and detection of DNA of leptospires in the dot-blot and situ hybridization with digoxigenin-labeled probes. Journal of West China University of Medical Sciences. 23 (4), 353-435 (1992).
  20. Mérien, F., Amouriaux, P., Perolat, P., Baranton, G., Saint Girons, I. Polymerase chain reaction for detection of Leptospira spp. in clinical samples. Journal of Clinical Microbiology. 30 (9), 2219-2224 (1992).
  21. Veerapandian, R., et al. Silver enhanced nano-gold dot-blot immunoassay for leptospirosis. Journal of Microbiological Methods. 156, 20-22 (2019).
  22. Junpen, S., et al. Evaluation of a monoclonal antibody-based dot-blot ELISA for detection of Leptospira spp in bovine urine samples. American Journal of Veterinary Research. 66 (5), 762-766 (2005).
  23. Ishmael, F. T., Stellato, C. Principles and applications of polymerase chain reaction: basic science for the practicing physician. Annals of Allergy, Asthma & Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma, & Immunology. 101 (4), 437-443 (2008).
  24. Boerner, B., Weigelt, W., Buhk, H. J., Castrucci, G., Ludwig, H. A sensitive and specific PCR/Southern blot assay for detection of bovine herpesvirus 4 in calves infected experimentally. Journal of Virological Methods. 83 (1-2), 169-180 (1999).
  25. Curry, E., Pratt, S. L., Kelley, D. E., Lapin, D. R., Gibbons, J. R. Use of a Combined duplex PCR/Dot-blot assay for more sensitive genetic characterization. Biochemistry Insights. 1, 35-39 (2008).
  26. Pilatti, M. M., Ferreira, S. deA., de Melo, M. N., de Andrade, A. S. Comparison of PCR methods for diagnosis of canine visceral leishmaniasis in conjunctival swab samples. Research in Veterinary Science. 87 (2), 255-257 (2009).
  27. Conrads, G., et al. PCR reaction and dot-blot hybridization to monitor the distribution of oral pathogens within plaque samples of periodontally healthy individuals. Journal of Periodontology. 67 (10), 994-1003 (1996).
  28. Langa, S., et al. Differentiation of Enterococcus faecium from Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and Streptococcus thermophilus strains by PCR and dot-blot hybridisation. International Journal of Food Microbiology. 88 (2-3), 197-200 (2003).
  29. Francesca, C., Lucilla, I., Marco, F., Giuseppe, C., Marisa, M. Identification of the unculturable bacteria Candidatus arthromitus in the intestinal content of trouts using dot-blot and Southern blot techniques. Veterinary Microbiology. 156 (3-4), 389-394 (2012).
  30. Arent, Z., Pardyak, L., Dubniewicz, K., Plachno, B. J., Kotula-Balak, M. Leptospira taxonomy: then and now. Medycyna Weterynaryjna. 78 (10), 489-496 (2022).
  31. Thibeaux, R., et al. Biodiversity of environmental Leptospira: Improving identification and revisiting the diagnosis. Frontiers in Microbiology. 9, 816 (2018).
  32. Carrillo-Casas, E. M., Hernández-Castro, R., Suárez-Güemes, F., de la Peña-Moctezuma, A. Selection of the internal control gene for real-time quantitative RT-PCR assays in temperature treated Leptospira. Current Microbiology. 56 (6), 539-546 (2008).
  33. Azali, M. A., Yean Yean, C., Harun, A., Aminuddin Baki A, N. N., Ismail, N. Molecular characterization of Leptospira spp. in environmental samples from North-Eastern Malaysia revealed a pathogenic strain, Leptospira alstonii. Journal of Tropical Medicine. 2016, 2060241 (2016).
  34. Ahmed, N., et al. Multilocus sequence typing method for identification and genotypic classification of pathogenic Leptospira species. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials. 5, 28 (2006).
  35. Bourhy, P., Collet, L., Brisse, S., Picardeau, M. Leptospira mayottensis sp. nov., a pathogenic species of the genus Leptospira isolated from humans. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 64, 4061-4067 (2014).
  36. Weiss, S., et al. An extended Multilocus Sequence Typing (MLST) scheme for rapid direct typing of Leptospira from clinical samples. PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (9), e0004996 (2016).
  37. Branger, C., et al. Polymerase chain reaction assay specific for pathogenic Leptospira based on the gene hap1 encoding the hemolysis-associated protein-1. FEMS Microbiology Letters. 243 (2), 437-445 (2005).
  38. Ren, S. X., et al. Unique physiological and pathogenic features of Leptospira interrogans revealed by whole-genome sequencing. Nature. 422 (6934), 888-893 (2003).
  39. Picardeau, M., et al. Genome sequence of the saprophyte Leptospira biflexa provides insights into the evolution of Leptospira and the pathogenesis of leptospirosis. PLOS One. 3 (2), e1607 (2008).
  40. Kafatos, F. C., Jones, C. W., Efstratiadis, A. Determination of nucleic acid sequence homologies and relative concentrations by a dot hybridization procedure. Nucleic Acids Research. 7 (6), 1541-1552 (1979).
  41. Bhat, A. I., Rao, G. P. Dot-blot hybridization technique. Characterization of Plant Viruses. , Springer Protocols Handbooks. Humana, NewYork, NY. 303-321 (2020).
  42. Yadav, J. P., Batra, K., Singh, Y., Singh, M. Comparative evaluation of indirect-ELISA and Dot-blot assay for serodetection of Mycoplasma gallisepticum and Mycoplasma synoviae antibodies in poultry. Journal of Microbiological Methods. 189, 106317 (2021).
  43. Malinen, E., Kassinen, A., Rinttilä, T., Palva, A. Comparison of real-time PCR with SYBR Green I or 5'-nuclease assays and dot-blot hybridization with rDNA-targeted oligonucleotide probes in quantification of selected faecal bacteria. Microbiology. 149, 269-277 (2003).
  44. Wyss, C., et al. Treponema lecithinolyticum sp. nov., a small saccharolytic spirochaete with phospholipase A and C activities associated with periodontal diseases. International Journal of Systematic Bacteriology. 49, 1329-1339 (1999).
  45. Shah, J. S., I, D. C., Ward, S., Harris, N. S., Ramasamy, R. Development of a sensitive PCR-dot-blot assay to supplement serological tests for diagnosing Lyme disease. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases: Official Publication of the European Society of Clinical Microbiology. 37 (4), 701-709 (2018).
  46. Niu, C., Wang, S., Lu, C. Development and evaluation of a dot-blot assay for rapid determination of invasion-associated gene ibeA directly in fresh bacteria cultures of E. coli. Folia microbiologica. 57 (6), 557-561 (2012).
  47. Wetherall, B. L., McDonald, P. J., Johnson, A. M. Detection of Campylobacter pylori DNA by hybridization with non-radioactive probes in comparison with a 32P-labeled probe. Journal of Medical Microbiology. 26 (4), 257-263 (1988).
  48. Kolk, A. H., et al. Detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical samples by using polymerase chain reaction and a nonradioactive detection system. Journal of Clinical Microbiology. 30 (10), 2567-2575 (1992).
  49. Scherer, L. C., et al. PCR colorimetric dot-blot assay and clinical pretest probability for diagnosis of Pulmonary Tuberculosis in smear-negative patients. BMC Public Health. 7, 356 (2007).
  50. Armbruster, D. A., Pry, T. Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation. The Clinical Biochemist Reviews. 29, S49-S52 (2008).
  51. Zhang, Y., Dai, B. Detection of Leptospira by dot-blot hybridization with photobiotin- and 32P-labeled DNA. Journal of West China University of Medical Sciences = Huaxi like daxue xuebao. 23 (2), 130-132 (1992).
  52. Terpstra, W. J., Schoone, G. J., ter Schegget, J. Detection of leptospiral DNA by nucleic acid hybridization with 32P- and biotin-labeled probes. Journal of Medical Microbiology. 22 (1), 23-28 (1986).
  53. Shukla, J., Tuteja, U., Batra, H. V. DNA probes for identification of leptospires and disease diagnosis. The Southeast Asian Journal of Tropical Medicine and Public Health. 35 (2), 346-352 (2004).
  54. Jiang, N., Jin, B., Dai, B., Zhang, Y. Identification of pathogenic and nonpathogenic leptospires by recombinant probes. Journal of West China University of Medical Sciences = Huaxi like daxue xuebao. 26 (1), 1-5 (1995).
  55. Fach, P., Trap, D., Guillou, J. P. Biotinylated probes to detect Leptospira interrogans on dot-blot hybridization or by in situ hybridization. Letters in Applied Microbiology. 12 (5), 171-176 (1991).
  56. Huang, N., Dai, B. Assay of genomic DNA homology among strains of different virulent leptospira by DNA hybridization. Journal of West China University of Medical Sciences = Huaxi like daxue xuebao. 23 (2), 122-125 (1992).
  57. Dong, X., Dai, B., Chai, J. Homology study of leptospires by molecular hybridization. Journal of West China University of Medical Sciences = Huaxi like daxue xuebao. 23 (1), 1-4 (1992).
  58. Komminoth, P. Digoxigenin as an alternative probe labeling for in situ hybridization. Diagnostic Molecular Pathology: The American Journal of Surgical Pathology, part B. 1 (2), 142-150 (1992).
  59. Saengjaruk, P., et al. Diagnosis of human leptospirosis by monoclonal antibody-based antigen detection in urine. Journal of Clinical Microbiology. 40 (2), 480-489 (2002).
  60. Okuda, M., et al. Enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of canine Leptospira antibodies using recombinant OmpL1 protein. The Journal of Veterinary Medical Science. 67 (3), 249-254 (2005).
  61. Suwimonteerabutr, J., et al. Evaluation of a monoclonal antibody-based dot-blot ELISA for detection of Leptospira spp in bovine urine samples. American Journal of Veterinary Research. 66 (5), 762-766 (2005).
  62. Kanagavel, M., et al. Peptide-specific monoclonal antibodies of Leptospiral LigA for acute diagnosis of leptospirosis. Scientific reports. 7 (1), 3250 (2017).
  63. Levett, P. N. Leptospirosis. Clinical Microbiology Reviews. 14 (2), 296-326 (2001).
  64. Monahan, A. M., Callanan, J. J., Nally, J. E. Proteomic analysis of Leptospira interrogans shed in urine of chronically infected hosts. Infection and Immunity. 76 (11), 4952-4958 (2008).
  65. Rojas, P., et al. Detection and quantification of leptospires in urine of dogs: a maintenance host for the zoonotic disease leptospirosis. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases: Official Publication of the European Society of Clinical Microbiology. 29 (10), 1305-1309 (2010).

Tags

Denne måneden i JoVE utgave 208 Leptospira Dot-blot PCR Digoxigenin
Polymerasekjedereaksjon og dot-blot-hybridisering for <i>Leptospira-deteksjon</i> i vannprøver
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Delgadillo-Tellez, E.,… More

Delgadillo-Tellez, E., Zavaleta-Villa, B., Atilano-López, D., Hernández-Castro, R., Olivo-Díaz, A., Carrillo-Casas, E. M. Polymerase Chain Reaction and Dot-Blot Hybridization for Leptospira Detection in Water Samples. J. Vis. Exp. (208), e65435, doi:10.3791/65435 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter