Summary
Den decellulariserede miltmatrix (DSM) har lovende anvendelser inden for levervævsteknik. Denne protokol skitserer proceduren til fremstilling af rotte-DSM, som omfatter høst af rottemilt, decellularisering af dem gennem perfusion og evaluering af den resulterende DSM for at bekræfte dens egenskaber.
Abstract
Levertransplantation er den primære behandling for leversygdom i slutstadiet. Manglen på og den utilstrækkelige kvalitet af donororganer nødvendiggør imidlertid udvikling af alternative behandlingsformer. Biokunstige lever (BAL'er) ved hjælp af decellulariseret levermatrix (DLM) har vist sig som lovende løsninger. Det er dog fortsat en udfordring at finde egnede DLM'er. Brugen af en decellulariseret miltmatrix (DSM) er blevet undersøgt som et fundament for BAL'er, der tilbyder et let tilgængeligt alternativ. I denne undersøgelse blev rottemilt høstet og decellulariseret ved hjælp af en kombination af fryse-optøningscyklusser og perfusion med decellulariseringsreagenser. Protokollen bevarede mikrostrukturerne og komponenterne i den ekstracellulære matrix (ECM) inden for DSM. Den komplette decellulariseringsproces tog ca. 11 timer, hvilket resulterede i en intakt ECM i DSM. Histologisk analyse bekræftede fjernelsen af cellulære komponenter, samtidig med at ECM's struktur og sammensætning blev bevaret. Den præsenterede protokol giver en omfattende metode til opnåelse af DSM, der tilbyder potentielle anvendelser inden for levervævsteknik og celleterapi. Disse resultater bidrager til udviklingen af alternative tilgange til behandling af leversygdom i slutstadiet.
Introduction
Levertransplantation er fortsat den eneste endelige behandling af leversygdomi slutstadiet 1,2,3. Den kritiske mangel og faldende kvalitet af donororganer har imidlertid øget behovet for alternativ behandling4. Inden for regenerativ medicin har biokunstige lever (BAL'er), der anvender decellulariseret levermatrix (DLM), vist sig at være lovende løsninger 5,6,7. DLM bevarer den oprindelige leverstruktur, herunder dets indviklede mikrovaskulære netværk og komponenter i ECM, og tilbyder et stillads til oprettelse af transplanterelige BAL'er, der potentielt kan lindre leversygdomme.
På trods af løftet står indførelsen af denne teknologi over for udfordringer, især med hensyn til indkøb af egnede DLM'er. Der er mangel på DLM'er fra mennesker, mens DLM'er fra animalske kilder indebærer risici for sygdomsoverførsel og immunafstødning. I en innovativ tilgang har vores forskning undersøgt brugen af en decellulariseret miltmatrix (DSM) som grundlag for BALs 8,9,10,11. Milt er lettere tilgængelige i forskellige medicinske situationer, såsom portalhypertension, traumatisk ruptur, idiopatisk trombocytopenisk purpura og donation efter hjertedød. Derfor er milt mere bredt tilgængelige end lever til forskningsformål. Patienter, der har gennemgået splenektomier, lider ikke af alvorlige tilstande, hvilket yderligere bekræfter miltens dispenserbarhed. Miltens mikromiljø, især den ekstracellulære matrix og sinusoider, ligner leverens. Dette gør milten til et egnet organ til celleadhæsion og proliferation i hepatocyttransplantationsforskning. Baseret på disse resultater har vores tidligere undersøgelser vist, at DSM'er deler sammenlignelige mikrostrukturer og komponenter med DLM'er og kan understøtte overlevelsen og funktionen af hepatocytter, herunder albumin- og urinstofproduktion. Desuden har DSM'er vist sig at forbedre leverdifferentieringen af mesenkymale stamceller fra knoglemarv, hvilket fører til forbedret og konsistent funktionalitet.
Ved at anvende DSM'er behandlet med heparin har vi konstrueret funktionelle BAL'er, der er i stand til at demonstrere effektiv kortvarig antikoagulation og delvis leverfunktionskompensation11. Derfor har denne tredimensionelle DSM et betydeligt løfte om fremskridt inden for levervævsteknik og celleterapi. I dette arbejde præsenterer vi de detaljerede metoder til høst af rottemilt og forberedelse af DSM, der bevarer mikrostrukturerne og komponenterne i ECM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne undersøgelse blev godkendt af Udvalget for Etik for Dyreforsøg ved Xi'an Jiaotong University og udført i overensstemmelse med retningslinjerne for pleje og brug af forsøgsdyr.
1. Milt høst
- Brug mandlige Sprague Dawley rotter, der vejer 250-280 g. Opstald rotterne i rum med kontrolleret temperatur og fugtighed, og giv dem mad og vand ad libitum, bortset fra faste før operationen.
- Subkutan injektion af buprenorphin (0,05 ml/kg) som smertestillende 1 time før operation. Bedøv rotten ved indånding af isofluran. Brug en strømningshastighed på 1,5 l / min på 5% isofluran til induktionsanæstesi i en plexiglasboks og vedligehold anæstesi med en strømningshastighed på 0,6-0,8 l / min på 2% isofluran gennem en maske. Bekræft dybden af anæstesi ved at klemme tæerne.
- Brug en elektrisk barbermaskine til at barbere huden over hele maven. Fastgør rotten i liggende stilling på operationsbordet. Injicer 2 ml hepariniseret saltvand (1.000 U heparin) via penis dorsale vene for at opnå systemisk antikoagulation. Desinficer den barberede hud med en povidon-jodopløsning og dæk med en steril draperingklud.
- Lav et korsformet snit ved hjælp af kirurgisk saks i maven, udsæt bughulen ved at strække med hæmostatiske tang, og vend leveren mod membranen. Udvendig mave-tarmkanalen til højre side af maven og dække den med fugtigt gasbind.
- Adskil forsigtigt og skær det splenogastriske ledbånd for at udsætte milthilumet.
BEMÆRK: Milten, der fremstår som en rødlig langstrakt struktur, ca. 3,0 cm x 0,6 cm x 0,6 cm i størrelse, kan identificeres i venstre del af maven. - Gradvist adskille og udsætte den fælles leverarterie, gastroduodenal arterie, og miltarterie ved dissekering langs milt hilum. Ligate og skære gastroduodenal arterie og fælles leverarterie, mens gradvist dissociere det omgivende væv.
- Vend milten mod højre side for at udsætte abdominal aorta. Udfør forsigtigt stump dissektion og udsæt abdominal aorta og cøliaki bagagerum ved hjælp af bomuldspinde. Placer en 3-0 silkesutur, ca. 3 cm lang, over og under cøliakistammens grene, og læg en 6-0 silkesutur, ca. 10 cm lang, ved grenen af cøliakistammen.
- Ligatur abdominal aorta under og over grene af cøliakistammen. Lav et lille snit ved arteriel gren. Løft forsigtigt 6-0 silkesuturen, indsæt et 24 G venøst kateter i miltarterien langs cøliakistammen, og ligér og fastgør det.
- Brug en sprøjtepumpe med en hastighed på 4 ml/min til at infundere hepariniseret normalt saltvand (25 E/ml) i et volumen på 50 ml. På samme tid skal du adskille portalvenen som en udstrømningskanal for at tillade den infunderede væske at strømme ud af milten. Dyret aflives ved ekssanguination.
- Disseker forsigtigt miltens omgivende væv, undgå beskadigelse af bugspytkirtlen, samtidig med at de store tilbehørsbeholdere bevares.
- Kontroller for lækage omkring milten, fjern derefter milten og bugspytkirtlen og skyl dem i normalt saltvand.
BEMÆRK: Milten og bugspytkirtlen hos rotter er tæt forbundet, med bugspytkirtlen indpakning omkring miltarterien. Hvis milten fjernes separat, kan det være udfordrende at ligere mange små blodkar. I denne procedure fjernes milten sammen med bugspytkirtlen. Efter decellularisering bliver milten og bugspytkirtlen gennemsigtig, og mikrovaskulaturen er synlig, hvilket letter bevarelsen af milten med intakte blodkar. - Milten overføres til et 50 ml centrifugerør fyldt med normalt saltvand og opbevares i en fryser til -80 °C.
BEMÆRK: Milten og det venøse kateter, der indsættes i miltarterien, vil blive kryopræserveret sammen for bekvem forbindelse under perfusionsforsøgene.
2. Milt decellularisering
- Gentag fryse-optøningscyklussen 3x i en steril beholder for at lyse miltcellerne.
BEMÆRK: Fryse-optøningscyklussen er en fysisk metode, der anvendes til stilladsdecellularisering. Miltvævet anbringes i en -80 °C fryser natten over til frysning, fjernes derefter fra lavtemperaturmiljøet og anbringes i stuetemperatur eller 37 °C vandbad til optøning. Denne fryse- og optøningsproces gentages 3-6 gange, hvilket forstyrrer cellemembraner og fører til cellelyse. - Opsæt et perfusionssystem i en ren bænk bestående af en peristaltisk pumpe, et 2 L reservoir, et silikonerør med en indvendig diameter på 2,4 mm og en boblefælde (figur 1).
- Fyld perfusionssystemet med deioniseret vand (ddH2O) og hold det kørende i 10 minutter.
- Overfør forsigtigt den høstede milt til ddH2O-fyldt beholder.
- Tilslut silikonerøret til det venøse kateter, der er indsat i miltarterien.
- Start perfusion med ddH2O med en hastighed på 2 ml / min i 30 minutter.
- Perfusion fortsættes med ddH2O med en hastighed på 4 ml/min i 30 minutter.
- Perfus med 0,1% (w/v) SDS-opløsning i 4 timer.
- Perfus med 1% (v/v) Triton X-100 opløsning i 2 timer.
- Perfus med PBS med en hastighed på 4 ml/min i 4 timer for at vaske DSM.
BEMÆRK: Brug af den peristaltiske pumpe til ensrettet perfusion af alle væsker. - Når perfusionen er afsluttet, ligere og transektere de vaskulære grene mellem bugspytkirtlen og milten, og fjern derefter bugspytkirtlen. Opbevar DSM i et rent og forseglet 50 ml centrifugerør gennemblødt i PBS indeholdende 10% penicillin-streptomycin ved -20 °C, indtil det er klar til brug til fremtidige forsøg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol udnyttede en kombination af gentagne fryse-optøningscyklusser og perfusion med decellulariseringsreagenser til decellularisering af rottemilt. Den fuldstændige decellularisering af milten blev opnået på ca. 11 timer (figur 2A). Gennem decellulariseringsprocessen overgik miltens farve gradvist fra dyb rød til et plettet, lys rødt og til sidst et hvidt gennemskinneligt udseende (figur 2B). Den overordnede morfologi forblev relativt intakt med synlige vaskulære strukturer (figur 2B).
Hematoxylin-eosinfarvning bekræftede fjernelsen af cellulære komponenter og afslørede en intakt ECM inden for DSM. Dette står i skarp kontrast til den oprindelige milt, som afbildet i figur 3A, hvor cellulære kerner og cytoplasmatiske elementer er synlige. Fraværet af celler blev yderligere bekræftet gennem 4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) farvning og måling af rest-DNA (DSM: 10,1 ± 4 ng/mg tørvægt, naturlig milt: 6,200 ± 300 ng/mg tørvægt). Scanning elektronmikroskopiske billeder afslørede den ultrastrukturelle karakterisering af DSM, som viste en bikagestruktur efter fuldstændig fjernelse af lymfocytter fra milten (figur 3C). Dette indikerede, at miltens decellularisering bevarede den normale milts ultrastruktur og arkitektur. For en mere omfattende evaluering af de afgørende ECM-proteiner, der er til stede i DSM, blev Masson-trichrom (figur 3B) og immunofluorescensfarvning anvendt. Specifikt blev kollagen I (figur 3D) og fibronectin (figur 3E) målrettet til analyse. Resultaterne viste, at både strukturelle og kældermembrankomponenter i ECM blev bevaret på samme måde som den oprindelige milt.
Figur 1: Den eksperimentelle opsætning. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Arbejdsprocessen for decellularisering og grove morfologiske ændringer. (A) Den decellulariserede miltmatrixforberedelsesarbejdsgang. Den fuldstændige decellularisering af milten blev opnået på ca. 11 timer. (B) Grove morfologiske ændringer af milten under fremstillingen af DSM. Under denne proces overgik miltens farve gradvist fra dyb rød til et plettet, lys rødt og til sidst et hvidt gennemskinneligt udseende. (B) 1. Efter gentagne fryse-optøningscyklusser og før decellularisering. 2. Efter skylning med deioniseret vand i 1 time. 3. Efter perfusion med SDS i 4 timer. 4. Efter perfusion med Triton i 2 timer. Forkortelser: DSM = decellulariseret miltmatrix; SDS = natriumdodecylsulfat; PBS = fosfatbufret saltvand PS = penicillin-streptomycin. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Morfologiske observationer af den decellulariserede miltmatrix. A) H&E-farvning (B) Masson trichrome farvning; c) SEM (D,E) Immunofluorescensfarvning af kollagen I og fibronectin; (F) DAPI-farvning. Skalastænger = 50 μm (A, B, D-F), 5 μm (C). Forkortelser: DSM = decellulariseret miltmatrix; H&E = hæmatoxylin-eosin; SEM = scanning elektronmikroskopi; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
BAL'erne repræsenterer en effektiv tilgang til behandling af leversygdom i slutstadiet, navnlig i tilfælde, hvor levertransplantation hindres af den nuværende mangel på donororganer6. En lovende mulighed for at skabe BAL'er er brugen af DLM, som bevarer den indfødte levers naturlige ECM og vaskulære struktur. Knapheden på humant DLM og de potentielle risici for infektion og immunogenicitet, der er forbundet med DLM fra dyr, udgør imidlertid betydelige begrænsninger. For at løse denne udfordring foreslår vi en ny strategi, der involverer anvendelse af en decellulariseret miltmatrix (DSM) som et alternativt stillads til BAL'er 8,9,10,11. Milt er lettere tilgængelige i forskellige kliniske scenarier og udviser lignende egenskaber som lever. I dette arbejde præsenterer vi detaljerede metoder til høst af rottemilt og forberedelse af DSM, der bevarer mikrostrukturerne og komponenterne i ECM.
En ideel decellulariseringsmetode ville fjerne cellulære komponenter, samtidig med at ECM 12,13,14's oprindelige struktur, sammensætning og mekaniske egenskaber bevares. Decellulariseringsmetoder omfatter fysiske, kemiske og enzymatiske behandlinger, hver med sine forskellige fordele og ulemper15. Selvom disse metoder delvist kan fjerne cellulære komponenter, kan de også kompromittere sammensætningen, strukturen og funktionaliteten af den resterende ECM. Kvaliteten af decellulariseringen kan påvirkes af variationer i celletæthed, matrixtykkelse og vævsmorfologi på tværs af forskellige vævskilder.
Til dato er der ingen guldstandard for decellulariseringsprocessen. Typisk er det simpelthen at anvende nogen af disse metoder utilstrækkelig til at minimere negative virkninger på ECM og maksimere fjernelsen af cellulært indhold. Derfor er den mest effektive tilgang afhængig af vævsegenskaberne, hvilket nødvendiggør en kombination af disse metoder. I denne undersøgelse brugte vi en protokol, der kombinerede fysiske metoder (fryse-optøningscyklusser og perfusion) med kemiske metoder (SDS og TritonX-100) til at decellularisere rottemilt.
Fryse-optøningscyklusserne fremmer cellelyse og hurtig løsrivelse af celler fra ECM16. Samtidig forbedrer perfusion gennem den oprindelige vaskulatur signifikant decellulariseringseffektiviteten og bevarer det oprindelige vaskulære netværk17. Natriumdodecylsulfat (SDS), der fungerer som et ionisk vaskemiddel, opløser dygtigt både celle- og nukleare membraner, hvilket fører til en mere omfattende fjernelse af cytoplasmatiske og nukleare komponenter. Denne proces forårsager imidlertid også skade på ECM-ultrastrukturen på grund af udtømningen af glycosaminoglycaner (GAG'er) og kollagen.
Forhøjede koncentrationer af SDS korrelerede med formindsket resterende DNA-indhold og reduceret mekanisk styrke i ECM-stilladset. Omvendt bevarede lavere koncentrationer af SDS en større mængde kollagen og inducerede mindre denaturering af ECM-proteiner. I modsætning hertil forstyrrer Triton X-100, der tjener som et ikke-ionisk vaskemiddel, effektivt lipid-lipid-, lipid-protein- og DNA-proteininteraktioner, hvilket giver en mildere tilgang til cellemembranopløsning. Ikke desto mindre viser det sig utilstrækkeligt til fuldstændig fjernelse af cellekerner og DNA. Derfor skal det kombineres med lave koncentrationer af SDS og fysiske behandlinger for at sikre fuldstændig fjernelse af cellulære komponenter, samtidig med at ECM's oprindelige struktur, sammensætning og ydeevne bevares. Det er vigtigt at bemærke, at resterende vaskemidler kan have en vis cytotoksicitet, så efterbehandling skylning med steril PBS eller destilleret vand er nødvendig før opbevaring.
En begrænsning af denne protokol er fraværet af kvantificering for resterende SDS og Triton X-100. Denne beslutning er informeret af både vores teams erfaring og bekræftende rapporter, som tyder på, at en 4 timers PBS-vask er tilstrækkelig til at fjerne disse stoffer effektivt. Desuden har vores tidligere cellekultureksperimenter, der anvender denne protokol, ikke vist tegn på cytotoksicitet. For at minimere protokollens udgifter blev der bevidst valgt at give afkald på kvantificering af resterende vaskemidler.
Afslutningsvis præsenterer denne protokol en gennemførlig metode til forberedelse af DSM'er, der demonstrerer effektivitet, stabilitet og minimal invasivitet. DSM'erne fremstillet ved hjælp af denne protokol opretholder miltens iboende arkitektur, sammensætning og naturlige vaskulære netværk. Desuden tilbyder det et stillads til celleimplantation og tredimensionel dynamisk kultur og derved etablerer et grundlag for at fremme undersøgelser i vævsmanipuleret lever.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har erklæret ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (82000624), Natural Science Basic Research Program of Shaanxi (2022JQ-899 &; 2021JM-268), Shaanxi Province Innovation Capability Support Program (2023KJXX-030), Shaanxi Province Key R&D Plan University Joint Project-Key Project (2021GXLH-Z-047), Institutional Foundation of The First Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University (2021HL-42 &; 2021HL-21).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia Machine | Harvard Apparatus | tabletop | animal anesthesia |
| bubble trap | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd. | pore diameter: 5 μm | prevent air bubbles |
| Buprenorphine | TIPR Pharmaceutical Responsible Co.,Ltd | an analgesic | |
| Hemostatic Forceps | Shanghai Medical Instruments Co., Ltd | J31020 | surgical tool |
| Heparinized Saline | SPH No.1 Biochemical & Pharmaceutical Co., LTD | prevent the formation of thrombosis | |
| Isoflurane | RWD life Science Co. | anesthetic:for the induction and maintenanceof anesthesia | |
| Penicillin-Streptomycin | Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | C0222 | antibiotics in vitro to prevent microbial contamination |
| Peristaltic Pump | Baoding Longer Precision Pump Co., Ltd. | BT100-1L | |
| Phosphate-Buffered Saline | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 4481228 | phosphoric acid buffer salt solution |
| Silicone Tube | Baoding Longer Precision Pump Co., Ltd. | 2.4×0.8mm | |
| Silk Suture | Yangzhou Jinhuan Medical Instrument Factory | 6-0 and 3-0 | ligate blood vessels |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 151-21-3 | ionic detergent, dissolves both cell and nuclear membranes |
| Syringe Pump | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd | BeneFusion SP5 | intravenous infusion |
| Triton X-100 | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 9002-93-1 | non-ionic detergent, disrupts lipid-lipid, lipid-protein, and DNA-protein interactions |
| Venous Catheter | B. Braun Company | 24G | inserting the spleen artery |
References
- Xu, X. State of the art and perspectives in liver transplantation. Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 22 (1), 1-3 (2023).
- Hautz, T., et al. Immune cell dynamics deconvoluted by single-cell RNA sequencing in normothermic machine perfusion of the liver. Nat Commun. 14 (1), 2285 (2023).
- Cardini, B., et al. Live confocal imaging as a novel tool to assess liver quality: insights from a murine model. Transplantation. 104 (12), 2528-2537 (2020).
- Ding, Y., et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes: a promising therapeutic agent for the treatment of liver diseases. Int J Mol Sci. 23 (18), 10972 (2022).
- Yaghoubi, A., et al. Prednisolone and mesenchymal stem cell preloading protect liver cell migration and mitigate extracellular matrix modification in transplanted decellularized rat liver. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 36 (2022).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat Med. 16 (7), 814-820 (2010).
- Xiang, J., et al. The effect of riboflavin/UVA cross-linking on anti-degeneration and promoting angiogenic capability of decellularized liver matrix. J Biomed Mater Res A. 105 (10), 2662-2669 (2017).
- Liu, P., et al. Implantation strategy of tissue-engineered liver based on decellularized spleen matrix in rats. J South Med Univ. 38 (6), 698-703 (2018).
- Xiang, J., et al. Decellularized spleen matrix for reengineering functional hepatic-like tissue based on bone marrow mesenchymal stem cells. Organogenesis. 12 (3), 128-142 (2016).
- Gao, R., et al. Hepatocyte culture in autologous decellularized spleen matrix. Organogenesis. 11 (1), 16-29 (2015).
- Liu, P., et al. Hemocompatibility improvement of decellularized spleen matrix for constructing transplantable bioartificial liver. Biomed Mater. 14 (2), 25003 (2019).
- Somuncu, Ö
- Neishabouri, A., Soltani, K. A., Daghigh, F., Kajbafzadeh, A. M., Majidi, Z. M. Decellularization in tissue engineering and regenerative medicine: evaluation, modification, and application methods. Front Bioeng Biotech. 10, 805299 (2022).
- Brown, M., Li, J., Moraes, C., Tabrizian, M., Li-Jessen, N. Decellularized extracellular matrix: New promising and challenging biomaterials for regenerative medicine. Biomaterials. 289, 121786 (2022).
- Gui, L., Muto, A., Chan, S. A., Breuer, C. K., Niklason, L. E. Development of decellularized human umbilical arteries as small-diameter vascular grafts. Tissue Eng Pt A. 15 (9), 2665-2676 (2009).
- Li, T., Javed, R., Ao, Q. Xenogeneic decellularized extracellular matrix-based biomaterials For peripheral nerve repair and regeneration. Curr Neuropharmacol. 19 (12), 2152-2163 (2021).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
