Summary
La matrice decellularizzata della milza (DSM) ha applicazioni promettenti nel campo dell'ingegneria del tessuto epatico. Questo protocollo delinea la procedura per la preparazione del DSM di ratto, che include la raccolta della milza di ratto, la loro decellularizzazione attraverso la perfusione e la valutazione del DSM risultante per confermarne le caratteristiche.
Abstract
Il trapianto di fegato è il trattamento principale per la malattia epatica allo stadio terminale. Tuttavia, la carenza e l'inadeguata qualità degli organi dei donatori richiedono lo sviluppo di terapie alternative. I fegati bioartificiali (BAL) che utilizzano la matrice epatica decellularizzata (DLM) sono emersi come soluzioni promettenti. Tuttavia, l'approvvigionamento di DLM adatti rimane impegnativo. L'uso di una matrice di milza decellularizzata (DSM) è stato esplorato come base per i BAL, offrendo un'alternativa prontamente disponibile. In questo studio, la milza di ratto è stata raccolta e decellularizzata utilizzando una combinazione di cicli di congelamento-disgelo e perfusione con reagenti di decellularizzazione. Il protocollo ha preservato le microstrutture e i componenti della matrice extracellulare (ECM) all'interno del DSM. Il processo completo di decellularizzazione ha richiesto circa 11 ore, risultando in una ECM intatta all'interno del DSM. L'analisi istologica ha confermato la rimozione dei componenti cellulari mantenendo la struttura e la composizione della MEC. Il protocollo presentato fornisce un metodo completo per ottenere il DSM, offrendo potenziali applicazioni nell'ingegneria dei tessuti epatici e nella terapia cellulare. Questi risultati contribuiscono allo sviluppo di approcci alternativi per il trattamento della malattia epatica allo stadio terminale.
Introduction
Il trapianto di fegato rimane l'unico trattamento definitivo per la malattia epatica allo stadio terminale 1,2,3. Tuttavia, la carenza critica e il declino della qualità degli organi dei donatori hanno aumentato la necessità di trattamenti alternativi4. Nel regno della medicina rigenerativa, i fegati bioartificiali (BAL) che utilizzano la matrice epatica decellularizzata (DLM) sono emersi come soluzioni promettenti 5,6,7. Il DLM preserva la struttura epatica originale, compresa la sua intricata rete microvascolare e i componenti della MEC, offrendo un'impalcatura per la creazione di BAL trapiantabili che potrebbero potenzialmente alleviare le malattie del fegato.
Nonostante le promesse, l'adozione di questa tecnologia deve affrontare delle sfide, in particolare nell'approvvigionamento di DLM adatti. I DLM di origine umana scarseggiano, mentre quelli di origine animale comportano rischi di trasmissione di malattie e rigetto immunitario. In un approccio innovativo, la nostra ricerca ha esplorato l'uso di una matrice milza decellularizzata (DSM) come base per i BAL 8,9,10,11. La milza è più facilmente disponibile in varie situazioni mediche, come l'ipertensione portale, la rottura traumatica, la porpora trombocitopenica idiopatica e la donazione dopo morte cardiaca. Pertanto, le milze sono più ampiamente disponibili dei fegati per scopi di ricerca. I pazienti che hanno subito splenectomie non soffrono di condizioni gravi, confermando ulteriormente la dispensabilità della milza. Il microambiente della milza, in particolare la matrice extracellulare e le sinusoidi, è simile a quello del fegato. Ciò rende la milza un organo adatto per l'adesione e la proliferazione cellulare nella ricerca sul trapianto di epatociti. Sulla base di questi risultati, le nostre precedenti indagini hanno dimostrato che i DSM condividono microstrutture e componenti comparabili con i DLM e possono supportare la sopravvivenza e la funzione degli epatociti, inclusa la produzione di albumina e urea. Inoltre, è stato dimostrato che i DSM migliorano la differenziazione epatica delle cellule staminali mesenchimali del midollo osseo, portando a una funzionalità migliore e coerente.
Utilizzando DSM trattati con eparina, abbiamo ingegnerizzato BAL funzionali in grado di dimostrare un'efficace anticoagulazione a breve termine e una parziale compensazione della funzionalità epatica11. Di conseguenza, questo DSM tridimensionale è una promessa significativa per il progresso dell'ingegneria del tessuto epatico e della terapia cellulare. In questo lavoro, presentiamo i metodi dettagliati di raccolta della milza di ratto e preparazione del DSM che preservano le microstrutture e i componenti dell'ECM.
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Protocol
Questo studio è stato approvato dal Comitato per l'etica degli esperimenti sugli animali dell'Università di Xi'an Jiaotong e condotto in conformità con le linee guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.
1. Raccolta della milza
- Utilizzare ratti Sprague Dawley maschi del peso di 250-280 g. Ospitare i ratti in stanze con temperatura e umidità controllate e fornire loro cibo e acqua ad libitum, tranne che per il digiuno prima dell'intervento chirurgico.
- Iniettare per via sottocutanea buprenorfina (0,05 ml/kg) come analgesico 1 ora prima dell'operazione. Anestetizzare il ratto mediante inalazione di isoflurano. Utilizzare una portata di 1,5 L/min di isoflurano al 5% per l'anestesia di induzione in una scatola di plexiglass e mantenere l'anestesia con una portata di 0,6-0,8 L/min di isoflurano al 2% attraverso una maschera. Conferma la profondità dell'anestesia pizzicando le dita dei piedi.
- Usa un rasoio elettrico per radere la pelle su tutto l'addome. Fissare il ratto in posizione supina sul tavolo operatorio. Iniettare 2 ml di soluzione salina eparinizzata (1.000 U di eparina) attraverso la vena dorsale del pene per ottenere l'anticoagulazione sistemica. Disinfettare la pelle rasata con una soluzione di iodio povidone e coprire con un panno sterile drappeggiato.
- Praticare un'incisione cruciforme con le forbici chirurgiche nell'addome, esporre la cavità addominale allungando con la pinza emostatica e capovolgere il fegato verso il diaframma. Esteriorizzare il tratto gastrointestinale sul lato destro dell'addome e coprirlo con una garza umida.
- Separare e tagliare con cura il legamento splenogastrico per esporre l'ilo splenico.
NOTA: La milza, che appare come una struttura allungata rossastra, di circa 3,0 cm x 0,6 cm x 0,6 cm, può essere identificata nell'addome sinistro. - Separare ed esporre gradualmente l'arteria epatica comune, l'arteria gastroduodenale e l'arteria splenica sezionando lungo l'ilo splenico. Legare e tagliare l'arteria gastroduodenale e l'arteria epatica comune dissociando progressivamente il tessuto circostante.
- Capovolgere la milza verso il lato destro per esporre l'aorta addominale. Eseguire delicatamente la dissezione smussata ed esporre l'aorta addominale e il tronco celiaco utilizzando tamponi di cotone. Posizionare una sutura di seta 3-0, di circa 3 cm di lunghezza, sopra e sotto i rami del tronco celiaco, e posizionare una sutura di seta 6-0, di circa 10 cm di lunghezza, in corrispondenza del ramo del tronco celiaco.
- Legatura dell'aorta addominale sotto e sopra i rami del tronco celiaco. Fai una piccola incisione sul ramo arterioso. Sollevare delicatamente la sutura di seta 6-0, inserire un catetere venoso da 24 G nell'arteria splenica lungo il tronco celiaco, legarlo e fissarlo.
- Utilizzando una pompa a siringa a una velocità di 4 ml/min, infondere soluzione fisiologica normale eparinizzata (25 U/mL) a un volume di 50 ml. Allo stesso tempo, recidere la vena porta come canale di deflusso per consentire al fluido infuso di defluire dalla milza. L'animale viene soppresso per dissanguamento.
- Sezionare con cura il tessuto circostante della milza, evitando danni al pancreas, preservando i principali vasi accessori.
- Verificare la presenza di eventuali perdite intorno alla milza, quindi rimuovere la milza e il pancreas e sciacquarli con soluzione fisiologica.
NOTA: La milza e il pancreas dei ratti sono strettamente collegati, con il pancreas che avvolge l'arteria splenica. Se la milza viene rimossa separatamente, può essere difficile legare numerosi piccoli vasi sanguigni. In questa procedura, la milza viene rimossa insieme al pancreas. Dopo la decellularizzazione, la milza e il pancreas diventano trasparenti ed è visibile la microvascolarizzazione, il che facilita la conservazione della milza con vasi sanguigni intatti. - Trasferire la milza in una provetta da centrifuga da 50 ml riempita con soluzione fisiologica normale e conservarla in congelatore a -80 °C.
NOTA: La milza e il catetere venoso inseriti nell'arteria splenica saranno crioconservati insieme per una comoda connessione durante gli esperimenti di perfusione.
2. Decellularizzazione della milza
- Ripetere il ciclo di congelamento-scongelamento 3 volte in un contenitore sterile per lisare le cellule della milza.
NOTA: Il ciclo di congelamento-disgelo è un metodo fisico utilizzato per la decellularizzazione dello scaffold. Il tessuto della milza viene posto in un congelatore a -80 °C per una notte per il congelamento, quindi rimosso dall'ambiente a bassa temperatura e posto in un bagno d'acqua a temperatura ambiente o a 37 °C per lo scongelamento. Questo processo di congelamento e scongelamento viene ripetuto 3-6 volte, il che interrompe le membrane cellulari e porta alla lisi cellulare. - Installare un sistema di perfusione all'interno di un banco pulito comprendente una pompa peristaltica, un serbatoio da 2 L, un tubo in silicone con un diametro interno di 2,4 mm e una trappola per bolle (Figura 1).
- Riempire il sistema di perfusione con acqua deionizzata (ddH2O) e mantenerlo in funzione per 10 min.
- Trasferire con cautela la milza raccolta nel contenitore riempito di O ddH2.
- Collegare il tubo di silicone al catetere venoso che è stato inserito nell'arteria splenica.
- Iniziare la perfusione con ddH2O a una velocità di 2 mL/min per 30 min.
- Continuare la perfusione con ddH2O a una velocità di 4 mL/min per 30 min.
- Perfondere con soluzione SDS allo 0,1% (p/v) per 4 ore.
- Perfondere con la soluzione di Triton X-100 all'1% (v/v) per 2 ore.
- Perfondere con PBS a una velocità di 4 ml/min per 4 ore per lavare il DSM.
NOTA: Utilizzo della pompa peristaltica per la perfusione unidirezionale di tutti i liquidi. - Al termine della perfusione, legare e sezionare i rami vascolari tra il pancreas e la milza, quindi rimuovere il pancreas. Conservare il DSM in una provetta da centrifuga da 50 ml pulita e sigillata imbevuta di PBS contenente il 10% di penicillina-streptomicina a -20 °C fino al momento dell'uso per esperimenti futuri.
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Representative Results
Questo protocollo utilizzava una combinazione di ripetuti cicli di congelamento-disgelo e perfusione con reagenti di decellularizzazione per la decellularizzazione della milza di ratto. La completa decellularizzazione della milza è stata raggiunta in circa 11 ore (Figura 2A). Durante il processo di decellularizzazione, il colore della milza è gradualmente passato dal rosso intenso a un rosso chiaro screziato e, infine, a un aspetto bianco traslucido (Figura 2B). La morfologia complessiva è rimasta relativamente intatta, con strutture vascolari visibili (Figura 2B).
La colorazione ematossilina-eosina ha confermato la rimozione dei componenti cellulari, rivelando una ECM intatta all'interno del DSM. Ciò è in netto contrasto con la milza nativa, come illustrato nella Figura 3A, dove sono visibili nuclei cellulari ed elementi citoplasmatici. L'assenza di cellule è stata ulteriormente confermata attraverso la colorazione con 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) e la misurazione del DNA residuo (DSM: 10,1 ± 4 ng/mg di peso secco, milza nativa: 6.200 ± 300 ng/mg di peso secco). Le immagini al microscopio elettronico a scansione hanno rivelato la caratterizzazione ultrastrutturale del DSM, che ha mostrato una struttura a nido d'ape dopo la completa rimozione dei linfociti dalla milza (Figura 3C). Ciò indicava che la decellularizzazione della milza preservava l'ultrastruttura e l'architettura della milza normale. Per una valutazione più completa delle proteine cruciali della MEC presenti all'interno del DSM, sono state impiegate la tricromia di Masson (Figura 3B) e la colorazione in immunofluorescenza. In particolare, il collagene I (Figura 3D) e la fibronectina (Figura 3E) sono stati presi di mira per l'analisi. I risultati hanno indicato che sia i componenti strutturali che quelli della membrana basale della MEC sono stati mantenuti in modo simile alla milza nativa.
Figura 1: La configurazione sperimentale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Il flusso di lavoro della decellularizzazione e dei cambiamenti morfologici macroscopici. (A) Il flusso di lavoro di preparazione della matrice della milza decellularizzata. La completa decellularizzazione della milza è stata raggiunta in circa 11 ore. (B) Cambiamenti morfologici macroscopici della milza durante la preparazione del DSM. Durante questo processo, il colore della milza è gradualmente passato dal rosso intenso a un rosso chiaro screziato e, infine, a un aspetto bianco traslucido. (B) 1. Dopo ripetuti cicli di gelo-disgelo e prima della decellularizzazione. 2. Dopo aver risciacquato con acqua deionizzata per 1 ora. 3. Dopo perfusione con SDS per 4 h. 4. Dopo perfusione con Tritone per 2 ore. Abbreviazioni: DSM = matrice milza decellularizzata; SDS = sodio dodecil solfato; PBS = soluzione salina tamponata con fosfato; PS = penicillina-streptomicina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Osservazioni morfologiche della matrice della milza decellularizzata. (A) Colorazione H&E; (B) colorazione tricromica di Masson; (C) SEM; (D,E) Colorazione in immunofluorescenza del collagene I e della fibronectina; (F) Colorazione DAPI. Barre di scala = 50 μm (A, B, D-F), 5 μm (C). Abbreviazioni: DSM = matrice milza decellularizzata; H&E = ematossilina-eosina; SEM = microscopia elettronica a scansione; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
I BAL rappresentano un approccio efficace per il trattamento della malattia epatica allo stadio terminale, in particolare nei casi in cui il trapianto di fegato è ostacolato dall'attuale carenza di organi da donatore6. Un'opzione promettente per la creazione di BAL è l'utilizzo del DLM, che preserva la MEC naturale e la struttura vascolare del fegato nativo. Tuttavia, la scarsità di DLM umano e i potenziali rischi di infezione e immunogenicità associati al DLM animale pongono limitazioni significative. Per affrontare questa sfida, proponiamo una nuova strategia che prevede l'impiego di una matrice milza decellularizzata (DSM) come scaffold alternativo per i BAL 8,9,10,11. La milza è più facilmente accessibile in vari scenari clinici e presenta caratteristiche simili al fegato. In questo lavoro, presentiamo metodi dettagliati di raccolta della milza di ratto e preparazione del DSM che preservano le microstrutture e i componenti dell'ECM.
Un metodo di decellularizzazione ideale rimuoverebbe i componenti cellulari mantenendo la struttura, la composizione e le proprietà meccaniche originali dell'ECM 12,13,14. I metodi di decellularizzazione comprendono trattamenti fisici, chimici ed enzimatici, ciascuno con i suoi distinti vantaggi e svantaggi15. Sebbene questi metodi possano rimuovere parzialmente i componenti cellulari, possono anche compromettere la composizione, la struttura e la funzionalità della MEC rimanente. La qualità della decellularizzazione può essere influenzata dalle variazioni della densità cellulare, dello spessore della matrice e della morfologia del tessuto tra diverse fonti di tessuto.
Ad oggi, non esiste un gold standard per il processo di decellularizzazione. In genere, il semplice impiego di uno di questi metodi è inadeguato per ridurre al minimo gli effetti negativi sulla MEC e massimizzare la rimozione del contenuto cellulare. Di conseguenza, l'approccio più efficace si basa sulle caratteristiche del tessuto, che richiedono una combinazione di questi metodi. In questo studio, abbiamo utilizzato un protocollo che combinava metodi fisici (cicli di gelo-disgelo e perfusione) con metodi chimici (SDS e TritonX-100) per decellularizzare la milza di ratto.
I cicli di congelamento-disgelo favoriscono la lisi cellulare e il rapido distacco delle cellule dalla ECM16. Allo stesso tempo, la perfusione attraverso il sistema vascolare nativo migliora significativamente l'efficienza della decellularizzazione e preserva la rete vascolare originale17. Il sodio dodecil solfato (SDS), funzionando come un detergente ionico, dissolve abilmente sia le membrane cellulari che quelle nucleari, portando a una rimozione più completa dei componenti citoplasmatici e nucleari. Tuttavia, questo processo infligge anche danni all'ultrastruttura della MEC a causa dell'esaurimento dei glicosaminoglicani (GAG) e del collagene.
Concentrazioni elevate di SDS erano correlate a un ridotto contenuto di DNA residuo e a una ridotta resistenza meccanica all'interno dell'impalcatura ECM. Al contrario, concentrazioni più basse di SDS hanno preservato una maggiore quantità di collagene e indotto una minore denaturazione delle proteine della MEC. Al contrario, Triton X-100, fungendo da detergente non ionico, interrompe efficacemente le interazioni lipidi-lipidi, lipidi-proteine e DNA-proteine, offrendo un approccio più blando alla dissoluzione della membrana cellulare. Tuttavia, si rivela inadeguato per la completa rimozione dei nuclei cellulari e del DNA. Pertanto, deve essere combinato con basse concentrazioni di SDS e trattamenti fisici per garantire la completa rimozione dei componenti cellulari preservando la struttura, la composizione e le prestazioni originali della MEC. È importante notare che i detergenti residui possono avere una certa citotossicità, quindi è necessario il risciacquo post-trattamento con PBS sterile o acqua distillata prima della conservazione.
Una limitazione di questo protocollo è l'assenza di quantificazione per SDS residua e Triton X-100. Questa decisione è informata sia dall'esperienza del nostro team che da rapporti corroboranti, che suggeriscono che un lavaggio PBS di 4 ore è sufficiente per rimuovere efficacemente queste sostanze. Inoltre, i nostri precedenti esperimenti di coltura cellulare che impiegano questo protocollo non hanno dimostrato alcun segno di citotossicità. Per ridurre al minimo le spese del protocollo, è stata fatta una scelta deliberata di rinunciare alla quantificazione dei detergenti residui.
In conclusione, questo protocollo presenta un metodo fattibile per la preparazione dei DSM, dimostrando efficienza, stabilità e minima invasività. I DSM preparati utilizzando questo protocollo mantengono l'architettura, la composizione e la rete vascolare naturale della milza. Inoltre, offre un'impalcatura per l'impianto cellulare e la coltura dinamica tridimensionale, stabilendo così una base per l'avanzamento delle indagini nel fegato di ingegneria tissutale.
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Disclosures
Gli autori non hanno dichiarato conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dalla National Natural Science Foundation of China (82000624), dal Programma di ricerca di base in scienze naturali dello Shaanxi (2022JQ-899 e 2021JM-268), dal Programma di supporto alle capacità di innovazione della provincia dello Shaanxi (2023KJXX-030), dal Piano di ricerca e sviluppo chiave della provincia dello Shaanxi, dal Progetto congiunto universitario-Progetto chiave (2021GXLH-Z-047), dalla Fondazione istituzionale del primo ospedale affiliato dell'Università di Xi'an Jiaotong (2021HL-42 e 2021HL-21).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia Machine | Harvard Apparatus | tabletop | animal anesthesia |
| bubble trap | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd. | pore diameter: 5 μm | prevent air bubbles |
| Buprenorphine | TIPR Pharmaceutical Responsible Co.,Ltd | an analgesic | |
| Hemostatic Forceps | Shanghai Medical Instruments Co., Ltd | J31020 | surgical tool |
| Heparinized Saline | SPH No.1 Biochemical & Pharmaceutical Co., LTD | prevent the formation of thrombosis | |
| Isoflurane | RWD life Science Co. | anesthetic:for the induction and maintenanceof anesthesia | |
| Penicillin-Streptomycin | Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | C0222 | antibiotics in vitro to prevent microbial contamination |
| Peristaltic Pump | Baoding Longer Precision Pump Co., Ltd. | BT100-1L | |
| Phosphate-Buffered Saline | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 4481228 | phosphoric acid buffer salt solution |
| Silicone Tube | Baoding Longer Precision Pump Co., Ltd. | 2.4×0.8mm | |
| Silk Suture | Yangzhou Jinhuan Medical Instrument Factory | 6-0 and 3-0 | ligate blood vessels |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 151-21-3 | ionic detergent, dissolves both cell and nuclear membranes |
| Syringe Pump | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd | BeneFusion SP5 | intravenous infusion |
| Triton X-100 | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 9002-93-1 | non-ionic detergent, disrupts lipid-lipid, lipid-protein, and DNA-protein interactions |
| Venous Catheter | B. Braun Company | 24G | inserting the spleen artery |
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