ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Мы опишем метод для извлечения высокой молекулярной геномной ДНК весом от биомассы планктона сосредоточена на 0,22 мкм фильтры Sterivex, затем хлорид цезия центрифугирования в градиенте плотности для очищения.
Abstract
Этот метод используется для получения высокой молекулярной геномной ДНК весом от биомассы планктона сосредоточена на 0,22 мкм фильтры Sterivex, которые были обработаны с хранением / лизис буфера и архивируются при -80 ° С, и, чтобы очистить эту ДНК с использованием градиента плотности цезия хлорид. Протокол начинается с двух часовую инкубацию шаги, чтобы освободить ДНК из клеток и удаления РНК. Далее, серия фенол: хлороформ и хлороформ извлечения выполняются с последующим центрифугированием для удаления белков и компонентов клеточной мембраны, сбор водного экстракта ДНК, и несколько буфер обмена шаги, чтобы вымыть и концентрат экстракта. Часть пятая описывает дополнительные очистки с помощью градиента плотности цезия хлорид. Рекомендуется работать с менее чем 15 образцов за один раз, чтобы избежать путаницы и сократить протокол времени. Общее время, необходимое для этого протокола зависит от количества образцов должны быть извлечены. За 10-15 образцов и при условии надлежащего оборудования центрифугирования доступен весь этот протокол должен занять 3 дня. Убедитесь, что у вас есть набор гибридизации печи до температуры, при начале процесса.
Protocol
Примечание: Все реагенты, используемые в настоящем протоколе аликвоты из лаборатории акций в небольших рабочих акции-это очень важно, чтобы избежать перекрестного загрязнения вашей ДНК образцов и загрязнения лабораторных запасов. Кроме того, когда пипетки, убедитесь, что менять наконечники для каждой того, чтобы избежать перекрестного загрязнения.
Часть первая: Лизис клетки и пищеварения
- Начните этот протокол таянием Sterivex фильтры, которые содержат ранее сосредоточены биомасса планктона на льду. Для простоты здесь мы опишем процедуру оформления отдельного фильтра. На практике, мы рекомендуем обработку 16 или меньше фильтров одновременно.
- Как только фильтр оттаяли, начинается первый из двух инкубации: один лизировать клетки и удаления РНК, и один, чтобы сломать белков. Для первой инкубации, добавьте 100 мкл лизоцима (125 мг в 1000 мкл ТЕ) и 20 мл РНКазы (10 мкг / мл) для фильтра. Reseal фильтр с парафильмом и оставить ее вращаться в гибридизации духовке при температуре 37 ° С в течение 1 часа.
- В течение следующих инкубации, добавьте 100 мкл протеиназы К и 100 мкл 20% SDS для фильтра. Reseal использованием парафильмом и оставить его, чтобы повернуть один-два часа больше гибридизации печь, на этот раз на 55 ° C.
- Использование 5cc шприца, передачу лизат из Sterivex фильтра в трубке 15 мл Falcon. Промойте фильтр с 1 мл буфера для лизиса и добавить промыть жидкости лизат в трубке Сокол использованием 5cc шприц. Теперь, когда вы лизируются и перевариваются вашим клеткам, вы готовы извлечь их ДНК.
Часть вторая: выделения ДНК
- Следующим шагом будет использование фенол-хлороформ метод извлечения ДНК из ваших лизат. Добавить равный объем (около 3 мл) фенола: хлороформ: изоамиловый спирт (IAA), чтобы лизат трубку, убедившись, что менять наконечники для каждой того, чтобы избежать перекрестного загрязнения. Vortex в течение 10 секунд, чтобы хорошо перемешать.
- Спиновые трубку в 2500 г в течение 5 минут, убедившись, что центрифуги является сбалансированным. Во время центрифугирования, фенол-хлороформ-лизат смесь должна разделиться на два слоя: органический слой, содержащий фенол, хлороформ, и белки с вашего образца, на дне, и водный слой, который состоит из вашей ДНК, воды и других более гидрофильных молекул, на вершине.
- Передача водный слой (содержащий ДНК) в новую 15 мл трубки Falcon. Будьте осторожны и не прикасайтесь интерфейс с кончика пипетки (всегда оставляют небольшое количество водного слоя сзади).
- С этой новой трубки, добавляют равный объем (примерно 3 мл) хлороформа: IAA, убедившись, что менять наконечники для каждой того, чтобы избежать перекрестного загрязнения. Vortex на 10 секунд. Этот шаг поможет удалить оставшиеся фенола из вашей ДНК образца.
- Спиновые в 2500 г в течение 5 минут или до водного слоя ясно. Передача водный слой в новый, помеченный трубки Сокол и добавьте 1 мл ТЕ при рН 8,0, стараясь не прикасаться к интерфейсу с кончика пипетки (всегда оставляют небольшое количество водного слоя сзади). Этот водный слой содержит вашу ДНК экстракта.
Часть третья: Концентрация ДНК и стиральная
- Следующим шагом будет мыть и сконцентрировать образец ДНК в 15 мл Amicon Ультра трубки центрифуги. Amicon труб состоят из фильтра, который сохраняет молекул при температуре не выше указанной молекулярной массой (ретентат) и трубки поймать проточные (фильтрата). В этом случае, фильтр сохраняет вашу ДНК (ретентат). Передавайте свои ДНК, выписка из шаг 2,5 до фильтра отсек Amicon Ультра трубки.
- Спиновые в 3500 г на 10 минут. Проверьте, чтобы убедиться, что составляет менее 1 мл жидкости задерживается в фильтре Amicon. Если более ретентат остается, заправка фильтр с TE и спина снова. Убедитесь, что используете свежие кончика пипетки для каждого ТЕ того, чтобы избежать перекрестного загрязнения.
- Удалить проточный или фильтрата, на другой трубке Сокол и сохранить его в холодильник, пока вы не подтвердите свой конечный продукт ДНК на геле (часть четвертая).
- Добавить 2 мл ТЕ-буфера для Amicon фильтр и спина в 3500 г в течение 6 минут, следя, чтобы использовать свежий кончиком пипетки для каждого ТЕ того, чтобы избежать перекрестного загрязнения. Бассейн фильтрата, что с шагом 3,3 и сохранить в холодильнике.
- Вымойте ДНК в два раза больше с TE в общей сложности три моет (убедитесь, что всегда использовать свежие кончика пипетки), и сохранение фильтрата каждый раз (как в шагах 3.3 и 3.4). За последние мыть, спина до 200 до 500 мл ретентат остается в фильтре Amicon. Запись конечного объема и передачи ретентат (содержащие ДНК), чтобы помечены 1,5 мл трубки Эппендорф.
Часть четвертая: Определение ДНК качества
- Проверьте качество ДНК и оценить концентрацию ДНК, запустив ваш образцов на гель 0,8% агарозном геле станцииINED с 1 мл этидий бромид (EtBr) в течение ночи. (Будьте предельно осторожны при использовании EtBr-то известно мутагенное и канцерогенное подозреваемых. Убедитесь в том, меняйте перчатки часто и избежать EtBr передачи остальной лаборатории и к вашей коже.) Загрузить образцы ДНК, рядом с лестницами, которые служат размер и интенсивность стандартами (см. следующий шаг).
- В первые несколько дорожек, лестниц нагрузки с группами различной молекулярной массы и концентрации. Мы рекомендуем следующую схему погрузки: в первой и последней полос (внешних дорожек), нагрузка 10 мкл 50ng/μl от 1 КБ + или 2log лестнице. В полосами 2,3 и 4, нагрузка 2 мкл, 5 мкл и 10 мкл, соответственно, лестницы 50ng/μl λHindIII. И наконец, нагрузка 5 мкл на полосу ДНК экстракт с красителем для каждого образца.
- Выполнить гель на 15 вольт в течение примерно 16 часов (мы рекомендуем запускать на ночь).
- На следующий день, фотографии геля с помощью УФ документации системы гель. Для определения молекулярного веса диапазон вашей ДНК и его концентрации, сравнение образцов полос полос лестниц. Хорошие качество ДНК будет высокой молекулярной массой (> 36кб), а также не наблюдается заметных признаков сдвига / деградации. См. Рис 1.
Часть пятая: Цезий центрифугирования в градиенте хлорида
- Если ДНК, качество хорошее и количества достаточно, вы можете приступить к очистке ДНК, выполняя хлорида цезия (CsCl) градиент центрифугирования. Обратите внимание, что это очищение шаг не является обязательным и не является необходимым для всех вниз по течению приложений (например, если вы хотите создать fosmid библиотеки, Вы должны очистить, а если вы просто хотите провести ПЦР, очистка обычно не требуется). Во-первых, этикетка одной центрифуги трубки для каждого образца.
- Чтобы каждая центрифуга трубки, добавляют 160 мг CsCl, 178 мкл геномной ДНК. После добавления CsCl и ДНК к трубе, поместите небольшой кусочек парафильмом в верхней части трубки и аккуратно переверните трубку десять-двадцать раз для того, чтобы смешивать компоненты. Не смешивать с помощью пипетки, что может привести стрижка ДНК. Затем добавьте 10 мкл 10 мкг / мкл EtBr к этой трубе и смешать его таким же образом. (Будьте предельно осторожны при использовании EtBr-то известно мутагенное и канцерогенное подозреваемых. Убедитесь в том, меняйте перчатки часто и избежать EtBr передачи остальной лаборатории и к вашей коже.)
- Убедитесь, что вес всех труб сбалансированы до центрифугирования, что масса различий между труб менее 1 мг.
- Место труб в роторе использованием кровоостанавливающего, закрыть крышкой и поместить внутри ротора ультрацентрифуге.
- Закрыть ультрацентрифуге дверь. Вакуумные будет применяться, как только вы закрываете дверь. Выполнить ночь в 100 тысяч оборотов в минуту в течение 18 часов и 20 ° C.
- При центрифугировании завершено, вынуть из трубы ротора использованием кровоостанавливающего и место на трубке стойку.
- Визуализируйте ДНК с синим светом transilluminator, или, если недоступен, использовать длинные ультрафиолетового света длиной волны, в темной комнате. Носите пара из янтаря очки фильтр, чтобы увидеть ДНК группы. См. рисунок 2.
- Использование стерильных 1cc шприцев и игл (26G 5 / 8), удаление ДНК группу и поместите его в 1,5 мл трубки Эппендорф.
- Чтобы помочь восстановить большую часть ДНК, захваченных в мертвое пространство в шприце, промойте шприц с 100 мкл ТЕ и добавить промыть решение трубки. Подготовка одну пробирку с 100 мкл буфера TE на один образец, чтобы предотвратить перекрестное заражение.
- Для удаления EtBr из ДНК, добавляют равный объем водонасыщенных бутанола к трубке, инвертировать трубы аккуратно десяти до двадцати, центрифуге при 10000 оборотов в минуту в течение 1 минуты и выбросить верхний слой.
- Повторите промывание, пока цвет бутанол прозрачна, 3 - 4 раза.
- Место 4 мл ТЕ в Amicon Ультра центрифужную пробирку и добавляют раствор ДНК сверху.
- Центрифуга в 3500 г при комнатной температуре, пока ДНК объем сократился примерно на 100-500 мкл (приблизительно 6-7 минут) и отказаться от проточных.
- Добавить 2 мл TE к Amicon фильтров и центрифуг в 3500 г в течение 6 минут, следя, чтобы использовать свежий кончиком пипетки для каждой того, чтобы избежать перекрестного загрязнения. Повторите два раза.
- Концентрат для конечного объема 50-100 мкл дополнительным центрифугированием при необходимости и передачи ДНК решение на фильтр для новой трубки 1,5 мл Eppendorf.
- Добавить 40 мкл ТЕ к Amicon фильтр и пипетку вверх и вниз вдоль обоих фильтров мембраны, чтобы смыть все оставшиеся ДНК. Добавить это решение для трубки в 5.15.
- Место микроконтроллер YM-30 фильтр в трубку микроконтроллер и предварительной стирки микроконтроллер путем добавления 200 мкл автоклавного водой и центрифугирования при 10000 оборотов в минуту в течение 7 минут.
- Добавить раствора ДНК с 5.16 до prewashed микроконтроллер с целью дальнейшего сосредоточиться ДНК. Центрифуга на 5000-10000 г на 1 - 3 минуты. Проверить количество жидкостина центрифугирования фильтра и повторять, пока количество жидкости на фильтре снижается примерно до 50 мкл.
- Место фильтра вниз головой в новую пробирку микроконтроллер и центрифуги в 1000 г на 3 минуты. Идеальное количество концентрированного раствора составляет 50-60 мкл.
- Измерьте и запишите концентрация ДНК на Nanodrop и проверьте пик качества (должно быть 260nm).
- Передача небольших аликвоту ДНК в чистую пробирку Eppendorf для работы фондовых и замерзает при минус 20. Передача остальных ДНК, чтобы второй чистый Эппендорф и заморозить при температуре минус 80.
Представитель Результаты:
Когда этот протокол будет сделано правильно, вы должны увидеть изображение геля после шага 4.4 в определении ДНК качества как на рисунке 1. Фактическая концентрация ДНК экстрактов варьируется в зависимости от источника образца. После шага 5.7 в центрифугирования в градиенте CsCl, геномной ДНК освещенных голубым светом должен выглядеть как на рисунке 2.
Рисунок 1. 0,8% агарозном гель-электрофореза изображение с высоким молекулярным весом ДНК собрана из четырех глубинах в субарктической части Тихого океана (в двух экземплярах), окрашивали интеркалирующего агента этидия бромид (10 мг / мл). Гель работает на 15В для ~ 16 часов в 1X TBE геля под управлением буфера. Пример полосы хорошего качества проявили особого доказательства механического сдвига (показывает одной полосы или пятна, а не несколько полос), хотя 10м экстракты сохраняют некоторые РНК переносится (см. мазок в 0,5 до 2,0 диапазон Kb).
Рисунок 2. Геномная ДНК группы освещенных голубым светом после центрифугирования в градиенте CsCl.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В зависимости от количества образцов, подлежащих обработке, это может быть временных затрат процедура из-за двух часовых этапов инкубации, а также неоднократные моет и центрифугирования шагов. Лучше всего планировать целых два дня эту процедуру, чтобы оставить достаточно времени. Если Есть проблемы с получением конечного объема экстракта в Amicon трубки уменьшить до 200-500 мкл при концентрации ДНК и мытья, попробуйте делать дополнительные моет ТЕ-и центрифугирования (повтор часть третья), пока соответствующий объем оставшихся. Кроме того, если экстракт запахи остро хлороформа, то лучше делать дополнительные моет, пока запах уменьшает чтобы убедиться, что все хлороформ удаляют. Опять же, все реагенты, используемые в настоящем протоколе аликвоты из лаборатории акций в небольших рабочих акции-это очень важно, чтобы избежать перекрестного загрязнения вашей ДНК образцов и загрязнения лабораторных запасов. Кроме того, когда пипетки, убедитесь, что менять наконечники для каждой того, чтобы избежать перекрестного загрязнения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Канадский фонд инноваций, знаний британской Колумбии Фонд развития и Национального наукам и инженерным исследованиям Совета (NSERC) Канады за поддержку проводимых исследований на регионах с низким уровнем кислорода в прибрежных и открытых водах океана. JJW была поддержана стипендии NSERC и ОУПЖ была поддержана стипендии NSERC, Киллам и ТУЛА основу финансируемого Центром микробного разнообразия и эволюции. SL была поддержана ТУЛА основу финансируемого Центром микробного разнообразия и эволюции.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 cc syringe (26G5/8 needle) | BD Biosciences | 309597 | |
| 1 ml syringe (26G5/8 needle) | BD Biosciences | 309597 | |
| 1.5ml eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| 15ml tubes | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
| 5cc syringe | BD Biosciences | 309603 | |
| Amicon® Ultra-4 Centrifugal Filter Devices | EMD Millipore | UFC801096 | 10,000 Nominal molecular weight limit |
| Butanol | Fisher Scientific | A383-1 | Make it water saturated (butanol:water = 1:1) |
| Centrifuge rotor, JA5.3 | Beckman Coulter Inc. | 368690 | |
| Centrifuge, Avanti® J-E | Beckman Coulter Inc. | 369003 | |
| Cesium chloride | Sigma-Aldrich | C4036 | |
| Chloroform:IAA (24:1) | Sigma-Aldrich | 25666-500ML | |
| Ethidium Bromide (EtBr) | Sigma-Aldrich | E1510-10ml | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Hybridization oven | Fisher Scientific | 13-247-10 | 37°C & 55°C |
| Lysis Buffer | 0.75 M sucrose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3) | ||
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876-5G | 125 mg in 1000 μl TE |
| Microcon® Ultracel YM-30 Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | 42410 | 50 bp cut off |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Phenol:Chloroform:IAA (25:24:1) | Sigma-Aldrich | 77617-500ML | |
| Proteinase K | Qiagen | 19133 | |
| RNase A | Fisher Scientific | BP2539-100 | 10 μg/ml |
| Safe Imager™ Blue light transilluminator | Invitrogen | S37102 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L4509 | 20% SDS |
| Sterivex filters | Fisher Scientific | SVG010RS | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| TE buffer, pH 8.0 | |||
| Trizma® base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Ultracentrifuge rotor, TLA 100 | Beckman Coulter Inc. | 343847 | |
| Ultracentrifuge tube (7X20mm, PC) | Beckman Coulter Inc. | 343775 | |
| Ultracentrifuge tube rack | Beckman Coulter Inc. | 348302 | |
| Ultracentrifuge, Optima® Max | Beckman Coulter Inc. |
References
- Beja, O. To BAC or not to BAC: marine ecogenomics. Curr Opin Biotechnol. 15 (3), 187-190 (2004).
- Beja, O., Suzuki, M. T. Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage. Environ Microbiol. 2 (5), 516-529 (2000).
- DeLong, E. F. Community genomics among stratified microbial assemblages in the oceans interior. Science. 311, 496-503 (2006).
- Stein, J. L., Marsh, T. L. Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon. J Bacteriol. 178 (3), 591-599 (1996).
- Somerville, C. C., Knight, I. T., Straube, W. L., Colwell, R. R. A simple, rapid method for the direct isolation of nucleic acids from aquatic environments. Appl. Environ. Microbiol. 55 (3), 548-554 (1989).
Tags
Молекулярная биология выпуск 31 микробиологии морской воды выделение ДНК хлорид цезия центрифугирования в градиенте плотностиErratum
Formal Correction: Erratum: DNA Extraction from 0.22 µM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation
Posted by JoVE Editors on 11/26/2014.
Citeable Link.
A correction was made to "DNA Extraction from 0.22 µM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation". A typo in a volume's measurement was corrected in step 1.2.
The step was corrected from:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 μl lysozyme (125 mg in 1000 μl TE) and 20 ml RNase A (10 μg/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37°C for 1 hour.
to:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 μl lysozyme (125 mg in 1000 μl TE) and 20 μl RNase A (10 μg/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37°C for 1 hour.
