ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Biz sezyum klorür yoğunluk gradiyenti santrifüj arıtma için 0.22 mikron Sterivex filtreler, konsantre planktonik biyokütle yüksek molekül ağırlıklı genomik DNA çıkarılması için bir metodu tanımlar.
Abstract
Bu yöntem, depolama / lizis tamponu ile tedavi edilen ve -80 ° C'de arşivlendi 0.22 mcM Sterivex filtreler üzerinde yoğunlaştı planktonik biyokütleden yüksek molekül ağırlıklı genomik DNA ayıklamak için, ve sezyum klorür yoğunluk gradiyenti kullanarak bu DNA arındırmak için kullanılır. Protokol, hücrelerin DNA kurtarmak ve RNA kaldırmak için iki kez birer saat inkübasyon adımlar ile başlar. Sonra, bir dizi fenol: kloroform ve kloroform ekstraksiyon, proteinler ve hücre zarı bileşenleri, sulu DNA özü toplama, ve özü yıkayın ve konsantre birkaç tampon değişim adımları kaldırmak için santrifüj yoluyla takip yapılır. Beşinci Bölüm, isteğe bağlı arıtma sezyum klorür yoğunluk gradiyenti ile açıklanmıştır. Bu karışıklığı önlemek ve protokol süresini azaltmak için tek seferde en az 15 örnek ile çalışmak tavsiye edilir. Bu protokol için gerekli toplam süre çıkarılan numune sayısı bağlıdır. 10-15 örnekler ve uygun santrifüj ekipmanları mevcut olduğu varsayılarak, tüm bu protokol, 3 gün sürmesi bekleniyor. Hibridizasyon fırınlar sürecin başında ısıya ayarlanmış olduğundan emin olun.
Protocol
Not: Bu protokolde kullanılan tüm reaktifler çalışma hisse senetleri bu DNA örnekleri ve laboratuar stoklarının kirlilik çapraz bulaşmayı önlemek için çok önemli küçük laboratuvar stokları aliquoted. Ayrıca, pipetleme, çapraz kontaminasyonu engellemek için her türlü ek için pipet uçları değiştirmek için emin olun.
Part One: Hücre Lizis ve Sindirim
- Bu protokol, buz üzerinde önceden konsantre planktonik biyokütle içeren Sterivex filtreler çözülme başlayın. Basitlik için, burada ayrı bir filtre işleme prosedürü tarif. Uygulamada, bir defada işlem 16 veya daha az filtreleri tavsiye ederiz.
- Filtre çözülmüş sonra, ilk iki inkubasyon başlar: biri olmuş akyuvarlar ve proteinleri yıkmak için, RNA, ve bir kaldırmak için. Ilk kuluçka dönemi için 100 ul lizozim (1000 ul TE 125 mg) ve 20 ml RNaz A (10 mg / ml), filtre ekleyin. Parafilm ile filtre Reseal ve hibridizasyon fırında ° C 'de 1 saat süreyle 37 ° döndürmek için bırakın.
- Sonraki kuluçka için 100 ul proteinaz K ve 100 ul% 20 SDS, filtre ekleyin. 55 Reseal hibridizasyon fırında 1-2 saat daha fazla döndürmek için Parafilm kullanarak ve bırakın bu kez ° C
- 5cc bir şırınga kullanılarak, 15 ml Falcon tüp içine Sterivex filtre lizat aktarın. 1 ml lizis tamponu ile filtre durulayın ve Falcon tüp içinde lizat 5cc şırınga ile sıvı durulama ekleyin. Şimdi size parçalanmış ve hücreleri sindirilir olduğunu, onların DNA ayıklamak için hazır.
Bölüm İki: DNA Ekstraksiyon
- Bir sonraki adım sizin lizat DNA ayıklamak için fenol-kloroform yöntemi kullanmaktır. Çapraz kontaminasyonu engellemek için her ek için pipet uçları değiştirmek için emin olun, lizat tüp izoamil Alkol (IAA): Kloroform: Fenol eşit hacmi (3ml hakkında) ekleyin. 10 saniye iyice karıştırın vorteksleyin.
- 5 dakika 2500 g santrifüj dengeli olduğundan emin Spin tüp. Alt örnekten fenol, kloroform ve protein içeren bir organik katmanı, DNA, su, sulu bir tabaka, ve diğer: santrifüj sırasında, fenol-kloroform-lizat karışımı iki kat ayırmalıdır üstüne daha hidrofilik molekülleri.
- Sulu tabaka (DNA içeren) yeni bir 15 ml Falcon tüp içine aktarın. Pipet ucu (her zaman arkasında sulu tabakanın küçük bir miktar terk) ile arayüz dokunmamaya dikkatli olun.
- Çapraz kontaminasyonu engellemek için her ek için pipet uçları değiştirmek için emin olun, IAA: Bu yeni tüp, Kloroform eşit hacmi (yaklaşık 3 ml) ekleyin. 10 saniye karıştırın. Bu adım, DNA örneği kalan herhangi bir fenol giderilmesine yardımcı olur.
- Sulu açıktır kadar 5 dakika veya 2500 g dönerler. Yeni, etiketli Falcon tüp içine aktarın ve sulu tabaka, pH 8.0 TE 1 ml pipet ucu (her zaman arkasında sulu tabakanın küçük bir miktar terk) ile arayüz dokunmamaya dikkat ederek ekleyin. Bu sulu DNA özü içerir.
Bölüm Üç: DNA Konsantrasyon ve Yıkama
- Bir sonraki adım, 15 ml Amicon Ultra santrifüj tüpüne DNA örneği yıkayın ve konsantre. Amicon tüpleri (süzüntü), akışı yakalamak için belirli bir molekül ağırlığına (retentate) ve bir tüp ya da yukarıda molekülleri tutar bir filtre oluşur. Bu durumda, filtre DNA (retentate) korur. Adım 2.5 DNA özü bir Amicon Ultra tüp filtre bölmesine aktarın.
- 3500 g de 10 dakika boyunca dönerler. Amicon filtre muhafaza sıvı az 1 ml olduğundan emin olmak için kontrol edin. Daha retentate kalır, TE filtre dolum ve tekrar döndürebilirsiniz. Çapraz kontaminasyonu engellemek için her TE ek için yeni bir pipet kullandığınızdan emin olun.
- Başka bir Falcon tüp akış yoluyla veya süzüntü çıkarın ve bir jel üzerinde son DNA ürün doğruladı kadar (Dördüncü Bölüm) buzdolabında saklayın.
- 2 ml TE tampon Amicon filtre ekleyin ve çapraz kontaminasyonu engellemek için her TE ek için yeni bir pipet kullanmak için emin olun, 6 dakika için 3500 g döndürün. Havuz adım 3.3 ile süzüntü ve buzdolabında saklayın.
- Üç yıkar (her zaman taze bir pipet kullanmak için emin olun) toplam TE DNA iki kez daha yıkayın ve (3.3 ve 3.4 gibi adım başı) süzüntü her zaman tasarrufu. Son yıkama, sıkma Amicon filtre retentate kalıntıların 200 ila 500 ml kadar. Son ses kaydetme ve etiketli 1.5 ml Eppendorf tüp (DNA içeren) retentate aktarmak.
Dördüncü Bölüm: DNA Kalitesinin Belirlenmesi
- DNA kalitesini kontrol edin ve bir jel% 0.8 agaroz jel sta örnekleri tükeniyor DNA konsantrasyonu tahmingecede 1ml ethidium bromür (EtBr) ile incelendiği. (Kullanırken son derece dikkatli olun EtBr bilinen bir mutajen ve şüpheli kanserojen eldivenler sık sık değiştirmek ve laboratuar geri kalanına ve cildinize EtBr transferini önlemek için emin olun.) Yük görevi, DNA merdivenler yanında örnekleri, büyüklüğü ve yoğunluğu standartları (sonraki adıma bakın).
- İlk birkaç şeritli, çeşitli molekül ağırlıkları ve konsantrasyon bantları ile merdivenler yük. Ilk ve son şerit (dıştaki şerit), 10 ul 1KB 50ng/μl, yük + veya 2log merdiven: Biz aşağıdaki yükleme deseni öneririz. 2,3 ve 4 şeritli yükü 2 ul, 5, ul ve 50ng/μl λHindIII merdivenin sırasıyla 10 ul,. Son olarak, her bir örnek için boya ile DNA özü her kulvar için 5 ul yükleyin.
- Jel, yaklaşık 16 saat için 15 volt (gece çalıştırmanızı öneririz) çalıştırın.
- Ertesi gün, bir UV jel dokümantasyon sistemi kullanılarak jel fotoğrafı. DNA ve konsantrasyonu moleküler ağırlığı aralığı belirlemek için örnek bantları, merdiven bantları karşılaştırın. İyi kalitede DNA yüksek molekül ağırlıklı (> 36KB) var ve çok az kanıt kesme / bozulma gösterecektir. Bkz: Şekil 1.
Beşinci Bölüm: Sezyum Klorür Gradient Santrifüj
- DNA kalitesi iyi ve miktarı yeterli değilse, bir sezyum klorür (CSCL) gradient santrifüj yaparak DNA arındırmak için devam edebilirsiniz. Bu arıtma adım isteğe bağlıdır ve downstream uygulamalar (örneğin, sadece PCR reaksiyonları gerçekleştirmek istiyorsanız ise, arıtma genellikle gerekli değildir, arındırmak GEREKEN fosmid kütüphaneleri oluşturmak istiyorsanız) için gerekli olduğunu unutmayın. Öncelikle, her bir örnek için bir santrifüj tüpüne etiket.
- Her bir santrifüj tüpüne, 160 CSCL mg, 178 ul genomik DNA ekleyin. Tüp CSCL ve DNA ekledikten sonra, parafilm tüpün üstüne küçük bir parça koyun ve bileşenleri karıştırmak için hafifçe tüp on ila yirmi kez ters çevirin. Pipetleme ile karıştırmayın, DNA kesme neden olabilir. Sonra bu tüp, 10 mikrogram / ul EtBr 10 ul aynı şekilde ekleyin ve karıştırın. (Kullanırken son derece dikkatli olun EtBr bilinen bir mutajen ve kanserojen şüpheli. Eldivenler sık sık değiştirmek ve laboratuar geri kalanına ve cildinize EtBr transferini önlemek için emin olun.)
- Tüpler arasındaki ağırlık farkı 1 mg daha az olduğu gibi santrifüj tüpleri ağırlığı önce dengeli olduğundan emin olun.
- Rotor kullanarak hemostat tüplerin yerleştirin, kapağını kapatın ve ultrasantrifüjdeki içindeki rotor.
- Ultrasantrifüjdeki kapağını kapatın. Vakum kapıya yakın olarak en kısa sürede yapılacaktır. 18 saat boyunca 100.000 rpm ve 20 ° C gece çalıştırın
- Santrifüj tamamlandığında, bir tüp raf hemostat ve yer kullanarak rotor tüpleri almak.
- Mavi ışık transilluminator'de ile DNA görselleştirin veya kullanılamaz, karanlık bir odada, uzun dalga boylu UV ışığı kullanın. DNA bant görmek için kehribar filtre gözlük bir çift giyin. Bakınız Şekil 2.
- 1 cc steril şırınga ve iğne (26g 5 / 8) kullanarak, DNA bandı çıkarın ve bir 1.5ml Eppendorf tüp içine koyun.
- Şırınga içinde ölü bir alan içinde sıkışıp DNA en kurtarmak yardımcı olmak için, 100 ul TE şırınga ile yıkayın ve tüp durulanır çözüm ekleyin. Çapraz kontaminasyonu önlemek için bir tüp numune başına 100 ul TE tampon ile hazırlayın.
- DNA EtBr kaldırmak için, yavaşça borular on ila yirmi kez, 1 dakika 10.000 rpm'de santrifüj invert tüpüne eşit hacimde su doymuş bütanol eklemek ve üst tabaka atın.
- - 4 kez daha bütanol renk, 3 şeffaf kadar yıkama işlemi tekrarlayın.
- Place 4 ml bir Amicon Ultra santrifüj tüpüne TE ve yukarıda DNA çözüm ekleyin.
- DNA hacmi yaklaşık 100-500 ul (yaklaşık 6-7 dakika) azalır kadar, 3500 g oda sıcaklığında santrifüj ve flow-through atın.
- 2ml TE Amicon filtre ekleyin ve çapraz kontaminasyonu engellemek için her ek için yeni bir pipet kullanmak için emin olun, 6 dakika için 3500 g santrifüj. Iki kez tekrarlayın.
- Konsantre gerekli gibi ek santrifüj 50-100 ul son bir hacmi ve yeni bir 1,5 ml Eppendorf tüp filtre DNA çözümü transfer.
- 40 ul TE Amicon filtre ekleyin ve kalan herhangi bir DNA yıkamak için her iki filtre membranlar boyunca yukarı ve aşağı pipetle. Bu çözüm, 5.15 tüp ekleyin.
- 200 ul otoklava su ekleyerek ve 7 dakika 10.000 rpm'de santrifüj Microcon tüp ve ön yıkama Microcon Microcon YM-30 filtre ünitesi yerleştirin.
- DNA daha fazla konsantre 5.16 den DNA çözümü amacıyla prewashed Microcon ekleyin. 1 - 3 dakika 5000-10000 g santrifüjleyin. Sıvı miktarını kontrol edin, filtre ve tekrar santrifüj filtre üzerinde sıvı miktarı yaklaşık 50 ul azalır kadar.
- , Yeni bir Microcon tüp içinde baş aşağı filtre ünitesi koyun ve 3 dakika 1000 g santrifüj. Konsantre çözüm ideal miktar 50-60 ul.
- Ve bir Nanodrop DNA konsantrasyonu ölçün, kayıt ve zirve kalite kontrol (260nm olmalıdır).
- DNA küçük bir kısım eksi 20 hisse senedi ve dondurma çalışmak için temiz bir Eppendorf tüp aktarın. DNA geri kalanı, eksi 80, ikinci bir temiz Eppendorf ve donma aktarın.
Temsilcisi Sonuçlar:
Bu protokol doğru yapıldığında, Şekil 1 'e benzer DNA kalitesinin belirlenmesi 4.4 adım sonra bir jel görüntü göreceksiniz. Gerçek DNA konsantrasyonu özler örnek kaynağına bağlı olarak değişir. CSCL degrade santrifüj 5.7 adım sonra, mavi ışık ile aydınlatılan genomik DNA Şekil 2 'e benzer bakmak gerekir.
Şekil 1 intercalating ajan etidyum bromür (10 mg / ml) ile boyandı güney kutup dairesine Pasifik Okyanusu (iki nüsha), dört derinliklerinde toplanan yüksek molekül ağırlıklı DNA% 0.8 agaroz jel elektroforezi görüntü. Jel 1X TBE jel çalışan tampon için 15V ~ 16 saat çalıştırıldı. Örnek bantları mekanik kesme (birden fazla bantları karşı tek bantlar veya smear gösterir) çok az kanıt gösteren kaliteli 10m özleri korumak rağmen bazı RNA (0,5 ila 2,0 Kb aralığında smear) üzerinde taşır.
Şekil 2 CSCL degrade santrifüj sonra mavi ışık ile aydınlatılan Genomik DNA bant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Işlenecek kaç örneklerindendir bağlı olarak, bu iki saatlik inkübasyon adımları ve tekrarlanan yıkama ve santrifüj adımları nedeniyle bir süre yoğun bir prosedür olabilir. Bol zaman terk etmek, bu işlem için iki tam gün planlamak için en iyisidir. Artık uygun hacmi kadar (Bölüm Üç tekrarlayın) ek TE yıkar ve santrüfüj yapmaya çalışın, DNA konsantrasyonu ve yıkama sırasında 200-500μl azaltmak için Amicon tüp nihai özü hacmi sorunları vardır. Ayrıca, eğer özü akut kloroform kokuyor, kokusu tüm kloroform kaldırılır emin olmak için azaltır kadar ek yıkar yapmak en iyisidir. Yine, bu protokolde kullanılan tüm reaktifler küçük çalışma içine laboratuvar stokları aliquoted hisse senetleri bu DNA örnekleri ve laboratuar stoklarının kirlilik çapraz bulaşmayı önlemek için çok önemlidir. Ayrıca, pipetleme, çapraz kontaminasyonu engellemek için her türlü ek için pipet uçları değiştirmek için emin olun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Yenilik, British Columbia Bilgi Kalkınma Fonu ve Ulusal Bilimler ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) Kanada Kanada Vakfı Biz, kıyı ve açık okyanus sularında düşük oksijen bölgelerde devam eden çalışmalar destek için teşekkür etmek istiyorum. JJW NSERC ve DAW burs tarafından desteklenen NSERC, Killam ve TULA vakıf Mikrobiyal Çeşitlilik ve Evrim finanse Merkezi burs tarafından desteklenmiştir. SL Mikrobiyal Çeşitlilik ve Evrim TULA vakıf tarafından finanse edilen Merkezi tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 cc syringe (26G5/8 needle) | BD Biosciences | 309597 | |
| 1 ml syringe (26G5/8 needle) | BD Biosciences | 309597 | |
| 1.5ml eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| 15ml tubes | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
| 5cc syringe | BD Biosciences | 309603 | |
| Amicon® Ultra-4 Centrifugal Filter Devices | EMD Millipore | UFC801096 | 10,000 Nominal molecular weight limit |
| Butanol | Fisher Scientific | A383-1 | Make it water saturated (butanol:water = 1:1) |
| Centrifuge rotor, JA5.3 | Beckman Coulter Inc. | 368690 | |
| Centrifuge, Avanti® J-E | Beckman Coulter Inc. | 369003 | |
| Cesium chloride | Sigma-Aldrich | C4036 | |
| Chloroform:IAA (24:1) | Sigma-Aldrich | 25666-500ML | |
| Ethidium Bromide (EtBr) | Sigma-Aldrich | E1510-10ml | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Hybridization oven | Fisher Scientific | 13-247-10 | 37°C & 55°C |
| Lysis Buffer | 0.75 M sucrose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3) | ||
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876-5G | 125 mg in 1000 μl TE |
| Microcon® Ultracel YM-30 Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | 42410 | 50 bp cut off |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Phenol:Chloroform:IAA (25:24:1) | Sigma-Aldrich | 77617-500ML | |
| Proteinase K | Qiagen | 19133 | |
| RNase A | Fisher Scientific | BP2539-100 | 10 μg/ml |
| Safe Imager™ Blue light transilluminator | Invitrogen | S37102 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L4509 | 20% SDS |
| Sterivex filters | Fisher Scientific | SVG010RS | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| TE buffer, pH 8.0 | |||
| Trizma® base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Ultracentrifuge rotor, TLA 100 | Beckman Coulter Inc. | 343847 | |
| Ultracentrifuge tube (7X20mm, PC) | Beckman Coulter Inc. | 343775 | |
| Ultracentrifuge tube rack | Beckman Coulter Inc. | 348302 | |
| Ultracentrifuge, Optima® Max | Beckman Coulter Inc. |
References
- Beja, O. To BAC or not to BAC: marine ecogenomics. Curr Opin Biotechnol. 15 (3), 187-190 (2004).
- Beja, O., Suzuki, M. T. Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage. Environ Microbiol. 2 (5), 516-529 (2000).
- DeLong, E. F. Community genomics among stratified microbial assemblages in the oceans interior. Science. 311, 496-503 (2006).
- Stein, J. L., Marsh, T. L. Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon. J Bacteriol. 178 (3), 591-599 (1996).
- Somerville, C. C., Knight, I. T., Straube, W. L., Colwell, R. R. A simple, rapid method for the direct isolation of nucleic acids from aquatic environments. Appl. Environ. Microbiol. 55 (3), 548-554 (1989).
Tags
Moleküler Biyoloji Sayı 31 mikrobiyoloji deniz suyu DNA izolasyonu sezyum klorür yoğunluk gradiyenti santrifüjErratum
Formal Correction: Erratum: DNA Extraction from 0.22 µM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation
Posted by JoVE Editors on 11/26/2014.
Citeable Link.
A correction was made to "DNA Extraction from 0.22 µM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation". A typo in a volume's measurement was corrected in step 1.2.
The step was corrected from:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 μl lysozyme (125 mg in 1000 μl TE) and 20 ml RNase A (10 μg/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37°C for 1 hour.
to:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 μl lysozyme (125 mg in 1000 μl TE) and 20 μl RNase A (10 μg/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37°C for 1 hour.
