تقرير من الحامض النووي من الجينات في مطبوع Arabidopsis السويداء
Summary
يطبع ظاهرة التكاثر في النباتات والثدييات. الحامض النووي يلعب دورا مهما في آليات يطبع. عزل وتحديد مركز السويداء مثيلة من الجينات في مطبوع<em> Arabidopsis</em> يمكن أن يكون صعبا. في هذا البروتوكول ، ونحن تصف كيفية عزل السويداء وتحديد التسلسل مثلأيشن بواسطة بيسلفيت.
Abstract
thaliana Arabidopsis هو كائن نموذجا ممتازا لدراسة آليات جينية. أحد الأسباب هو متحولة خالية من خسارة وظيفة من methyltransferases الحمض النووي قابلة للحياة ، وبالتالي توفير نظام لدراسة كيفية فقدان الحامض النووي في الجينوم يؤثر على النمو والتنمية. يطبع التعبير يشير إلى الفرق الأليلات الأم والأب ، ويلعب دورا هاما في عملية التنمية في كل من استنساخ الثدييات والنباتات. الحامض النووي هو أمر حاسم لتحديد ما إذا كان يتم التعبير عن الأب أو الأم الأليلات لجينة مطبوع أو إسكاته. في النباتات المزهرة ، وهناك حدث الإخصاب مزدوجة في الاستنساخ : خلية واحدة يخصب الحيوان المنوي البويضة لتشكيل خلية الجنين والصمامات الحيوانات المنوية الثاني مع الخلية المركزية تثير السويداء. السويداء هو الأنسجة حيث يطبع يحدث في النباتات. MEDEA ، مجموعة مجموعة الجينات Polycomb المجال ، وFWA ، وهو عامل النسخ تنظيم المزهرة ، هم أول اثنين من الجينات أظهرت أن تكون مطبوعة في السويداء والتعبير عنها هي التي تسيطر عليها الحامض النووي ونزع الميثيل في النباتات. من أجل تحديد الوضع يطبع من الجينات ونمط مثيلة في السويداء ، ونحن بحاجة إلى أن تكون قادرة على عزل السويداء الأول. منذ البذور صغيرة في Arabidopsis ، فإنه لا يزال تحديا لعزل السويداء Arabidopsis ودراسة مثيلة لها. في هذا البروتوكول الفيديو ، فإننا تقرير كيفية إجراء عبر الجينية ، لعزل نسيج السويداء من البذور ، وتحديد حالة مثيلة بواسطة التسلسل بيسلفيت.
Protocol
Discussion
فمن السهل نسبيا لفصل جنين من السويداء ، ومعطف البذور ، لكنها مملة لفصل السويداء من معطف البذور ، وخاصة بالنسبة للبذور في مرحلة مبكرة أو منتصف الطوربيد ، من مرحلة التطور الجنيني. منذ معطف البذور يساهم سوى كمية صغيرة جدا من الأنسجة ، وبالنسبة لبعض الجينات ، مثل الشرق …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب أشكر السيدة جنيفر M. وميل وتارا Rognan N. لصيانة النباتات Arabidopsis. وأيد هذا العمل من جانب صناديق المبتدئة من جامعة سانت لويس والمعاهد الوطنية للصحة منح 1R15GM086846 – 01 – 01S1 و3R15GM086846 إلى شياو دبليو.
Materials
Supplies
- Dissecting Microscope
- Scissors
- Fine Tip Forceps
- Jewelry Tag
- Plant Stakes
- String or Twist-Ties
- 4″ X 2″ X 8″ Polyethylene Bags
- 3″ X 1″ X 1.0 mm Microscope Slides
- Liquid Nitrogen
- Liquid Nitrogen Containers
- Heat Block
- PCR Tubes
- Thermocycler
- Microcentrifuge Tubes
- Microcentrifuge
- Gel Electrophoresis facility
- Arabidopsis thaliana Columbia-0 Plants
- Arabidopsis thaliana Landsberg erecta Plants
Reagents
- 70% Ethanol
- 95% Ethanol
- 100% Ethanol
- 0.3 M Sorbitol and 5 mM MES-pH 5.7
- Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB)
- 100% Ethanol
- Cholorform
- Restriction Enzymes
- 3 M NaOH
- 6.3 M NaOH
- 6.24 M Urea/ 4 M Sodium Bisulfite
- Sterile distilled H2O
- 10 mM Hydroquinone
- Wizard DNA Clean-Up System (Promega)
- 10 M NH4OAc
- 20 μg/ μL tRNA
- TE buffer
- The TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)
Riferimenti
- Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).
- Cokus, S. J., Feng, S., Zhang, X., Chen, Z., Merriman, B., Haudenschild, C. D., Sriharsa Pradhan, S., Nelson, S. F., Pellegrini, M., Jacobsen, S. E. Shotgun bisulphite sequencing of the Arabidopsis genome reveals DNA methylation patterning. Nature. 452, 215-219 (2008).
- Frommer, M., McDonald, L. E., Millar, D. S., Collis, C. M., Watt, F., Grigg, G. W. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc Natl Acad Sci USA. 89, 1827-1831 (1992).
- Gehring, M., Huh, J. H., Hsieh, T. F., Penterman, J., Choi, Y., Harada, J. J., Goldberg, R. B., Fischer, R. L. D. E. M. E. T. E. R. DNA glycosylase establishes MEDEA polycomb gene self-imprinting by allele-specific demethylation. Cell. 124, 495-506 (2006).
- Henderson, I. R., Chan, S. R., Cao, X., Johnson, L., Jacobsen, S. E. Accurate sodium bisulfite sequencing in plants. Epigenetics. 5, 47-49 (2010).
- Hsieh, T. F., Ibarra, C. A., Silva, P., Zemach, A., Eshed-Williams, L., Fischer, R. L., Zilberman, D. Genome-wide demethylation of Arabidopsis endosperm. Science. 324, 1451-1454 (2009).
- Jacobsen, S. E., Sakai, H., Finnegan, E. J., Cao, X., Meyerowitz, E. M. Ectopic hypermethylation of flower-specific genes in Arabidopsis. Curr. Biol. 10, 179-186 (2000).
- Kinoshita, T., Miura, A., Choi, Y., Kinoshita, Y., Cao, X., Jacobsen, S. E., Fischer, R. L., Kakutani, T. One-way control of FWA imprinting in Arabidopsis endosperm by DNA methylation. Science. 303, 521-523 (2004).
- Lister, R., O’Malley, R. C., Tonti-Filippini, J., Gregory, B. D., Berry, C. C., Millar, A. H., Ecker, J. R. Highly integrated single-base resolution maps of the epigenome in Arabidopsis. Cell. 133, 523-536 (2008).
- Lister, R., Pelizzola, M., Dowen, R. H., Hawkins, R. D., Hon, G., Tonti-Filippini, J., Nery, J. R., Lee, L., Ye, Z., Ngo, Q. -. M. Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences. Nature. 462, 315-322 (2009).
- Paulin, R., Grigg, G. W., Davey, M. W., Piper, A. A. Urea improves efficiency of bisulfite-mediated sequencing of 5′- methylcytosine in genomic DNA. Nucl. Acids Res. 26, 5009-5010 (1998).
- Rogers, S. O., &, B. e. n. d. i. c. h., J, A. Extraction of DNA from plant tissues. Plant Molecular Biology Manual. A6, 1-10 (1988).
- Smyth, D. R., Bowman, J. L., Elliot, M., Meyerowitz, E. M. Early Flower Development in Arabídopsis. Plant Cell. 2, 755-767 (1990).
- Xiao, W., Gehring, M., Choi, Y., Margossian, L., Pu, H., Harada, J. J., Goldberg, R. B., Pennell, R. I., Fischer, R. L. Imprinting of the MEA Polycomb gene is controlled by antagonism between MET1 methyltransferase and DME glycosylase. Dev. Cell. 5, 891-901 (2003).
