Determinación de la metilación del ADN de los genes impresos en Arabidopsis Endospermo
Summary
La impresión es un fenómeno en la planta y reproducción de los mamíferos. Metilación del ADN juega un papel importante en los mecanismos de impresión. Aislar endospermo y determinar el estado de metilación de los genes impresos en<em> Arabidopsis</em> Puede ser difícil. En este protocolo, se describe cómo aislar endospermo y determinar la metilación de la secuenciación de bisulfito.
Abstract
Arabidopsis thaliana es un organismo modelo excelente para estudiar los mecanismos epigenéticos. Una de las razones es el mutante nulo de pérdida de función de ADN metiltransferasa es viable, proporcionando así un sistema para estudiar cómo la pérdida de metilación del ADN en el genoma afecta el crecimiento y desarrollo. La impronta se refiere a la expresión diferencial de los alelos maternos y paternos, y juega un papel importante en el desarrollo de la reproducción, tanto en mamíferos y plantas. Metilación del ADN es fundamental para determinar si los alelos maternos y paternos de un gen impreso se expresa o se silencian. En las plantas con flores, hay un evento de doble fertilización en la reproducción: un espermatozoide fertiliza el óvulo para formar un embrión y el espermatozoide se fusiona con la célula de segundo central para dar lugar a endospermo. Endospermo es el tejido donde se produce en las plantas de impresión. MEDEA, un dominio establecido Polycomb gen del grupo, y la FWA, un factor de transcripción que regulan la floración, son los dos primeros genes demostrado ser impreso en el endospermo y su expresión está controlada por la metilación del ADN y desmetilación en las plantas. Con el fin de determinar el estado de impresión de un gen y el patrón de metilación en el endospermo, tenemos que ser capaces de aislar primero endospermo. Desde la semilla es muy pequeña en Arabidopsis, que sigue siendo un reto para aislar endospermo Arabidopsis y examinar su metilación. En este protocolo de vídeo, se presenta la manera de realizar un cruce genético, para aislar el tejido del endospermo de las semillas, y para determinar el estado de metilación de la secuenciación de bisulfito.
Protocol
Discussion
Es relativamente fácil de separar del embrión y endospermo cubierta de la semilla, pero es tedioso para separar el endospermo de la cáscara de la semilla, especialmente para las semillas en la etapa de principios o mediados de torpedo de la embriogénesis. Desde cubierta de la semilla sólo aporta una pequeña cantidad de tejido, para algunos genes, por ejemplo, MEA y FWA, no hay que separar el endospermo de la cáscara de la semilla. Esto significa que podemos aislar ARN a partir de una mezcla de e…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a la Sra. Jennifer M. Lommel y Tara N. Rognan para el mantenimiento de plantas de Arabidopsis. Este trabajo fue apoyado por la puesta en marcha de fondos de la Universidad de Saint Louis y los Institutos Nacionales de Salud subvenciones 1R15GM086846-01 y 3R15GM086846-01S1 a W. Xiao.
Materials
Supplies
- Dissecting Microscope
- Scissors
- Fine Tip Forceps
- Jewelry Tag
- Plant Stakes
- String or Twist-Ties
- 4″ X 2″ X 8″ Polyethylene Bags
- 3″ X 1″ X 1.0 mm Microscope Slides
- Liquid Nitrogen
- Liquid Nitrogen Containers
- Heat Block
- PCR Tubes
- Thermocycler
- Microcentrifuge Tubes
- Microcentrifuge
- Gel Electrophoresis facility
- Arabidopsis thaliana Columbia-0 Plants
- Arabidopsis thaliana Landsberg erecta Plants
Reagents
- 70% Ethanol
- 95% Ethanol
- 100% Ethanol
- 0.3 M Sorbitol and 5 mM MES-pH 5.7
- Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB)
- 100% Ethanol
- Cholorform
- Restriction Enzymes
- 3 M NaOH
- 6.3 M NaOH
- 6.24 M Urea/ 4 M Sodium Bisulfite
- Sterile distilled H2O
- 10 mM Hydroquinone
- Wizard DNA Clean-Up System (Promega)
- 10 M NH4OAc
- 20 μg/ μL tRNA
- TE buffer
- The TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)
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