에 각인 유전자의 DNA Methylation의 결정 Arabidopsis 배젖
Summary
각인은 식물과 동물의 복제에 현상입니다. DNA의 methylation은 각인의 메커니즘에서 중요한 역할을합니다. 배젖를 분리 및 각인 유전자의 methylation 상태를 결정<em> Arabidopsis</em>는 어려울 수 있습니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 배젖를 분리하고 bisulfite의 시퀀싱에 의해 methylation을 결정하는 방법에 대해 설명합니다.
Abstract
Arabidopsis thaliana은 epigenetic 메커니즘을 연구를위한 훌륭한 모델 생물이다. 그 이유 중 하나는 DNA의 methyltransferases의 손실 함수 NULL의 돌연변이가 따라서 게놈에있는 DNA의 methylation의 손실이 성장과 발전에 미치는 영향 연구하는 시스템을 제공하고, 실용적입니다. 각인은 모자 아버지의 대립 유전자의 미분 표현을 나타냅니다과 포유 동물과 식물 모두에서 복제 개발에 중요한 역할을합니다. DNA의 methylation은 각인 유전자의 모자 또는 아버지 대립 유전자가 표현하거나 침묵 여부를 결정하는 것이 중요합니다. 꽃 식물에서, 복제에서 더블 수정 이벤트가있다 : 한 정자 세포는 배젖을 일으키다 수있는 중앙 세포와 배아 그리고 두 번째 정자 퓨즈를 형성하기 위해 난자를 fertilizes. 배젖은 각인이 공장에서 발생하는 조직입니다. 메데아, SET 도메인 Polycomb 그룹 유전자 및 FWA, 꽃을 조절 전사 인자는 배젖 및 표현에 인쇄되는 표시된 처음 두 유전자 아르의 DNA의 methylation과 demethylation에 의해 제어됩니다 식물. 유전자와 배젖의 methylation 패턴의 각인 상태를 결정하기 위해, 먼저 배젖를 분리 수 있어야합니다. 씨앗 Arabidopsis에서 작은 있기 때문에, 그것은 Arabidopsis 배젖를 분리하고 methylation을 확인하기 위해 도전 남아 있습니다. 이 비디오 프로토콜에서는, 우리는 씨앗에서 배젖 조직을 분리, 유전자 십자가를 실시하고, bisulfite의 시퀀싱에 의해 methylation 상태를 확인하는 방법을보고합니다.
Protocol
Discussion
그것은 배젖 및 종자 코트에서 배아를 분리하는 것이 비교적 쉽기는하지만 embryogenesis의 초기 또는 중간 단계에서 어뢰 특히 씨앗을 위해, 종자 코트에서 배젖를 구분 지루합니다. 종자 코팅은 일부 유전자에 대한 조직의 매우 작은 금액을 기여 때문에, 예를 들어, MEA와 FWA, 우리는 종자 코트에서 배젖를 구분하지 않아도됩니다. 우리가 배젖 및 종자 코트 조직의 혼합물에서 RNAS을 분리할 수?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 Arabidopsis 식물의 유지 보수를 위해 양 제니퍼 M. Lommel와 타라 N. Rognan 감사합니다. 이 작품은 건강 보조금 1R15GM086846 – 01와 W. 샤오에 3R15GM086846 – 01S1의 세인트 루이스 대학과 국립 연구소에서 시작 기금에 의해 지원되었다.
Materials
Supplies
- Dissecting Microscope
- Scissors
- Fine Tip Forceps
- Jewelry Tag
- Plant Stakes
- String or Twist-Ties
- 4″ X 2″ X 8″ Polyethylene Bags
- 3″ X 1″ X 1.0 mm Microscope Slides
- Liquid Nitrogen
- Liquid Nitrogen Containers
- Heat Block
- PCR Tubes
- Thermocycler
- Microcentrifuge Tubes
- Microcentrifuge
- Gel Electrophoresis facility
- Arabidopsis thaliana Columbia-0 Plants
- Arabidopsis thaliana Landsberg erecta Plants
Reagents
- 70% Ethanol
- 95% Ethanol
- 100% Ethanol
- 0.3 M Sorbitol and 5 mM MES-pH 5.7
- Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB)
- 100% Ethanol
- Cholorform
- Restriction Enzymes
- 3 M NaOH
- 6.3 M NaOH
- 6.24 M Urea/ 4 M Sodium Bisulfite
- Sterile distilled H2O
- 10 mM Hydroquinone
- Wizard DNA Clean-Up System (Promega)
- 10 M NH4OAc
- 20 μg/ μL tRNA
- TE buffer
- The TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)
Riferimenti
- Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).
- Cokus, S. J., Feng, S., Zhang, X., Chen, Z., Merriman, B., Haudenschild, C. D., Sriharsa Pradhan, S., Nelson, S. F., Pellegrini, M., Jacobsen, S. E. Shotgun bisulphite sequencing of the Arabidopsis genome reveals DNA methylation patterning. Nature. 452, 215-219 (2008).
- Frommer, M., McDonald, L. E., Millar, D. S., Collis, C. M., Watt, F., Grigg, G. W. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc Natl Acad Sci USA. 89, 1827-1831 (1992).
- Gehring, M., Huh, J. H., Hsieh, T. F., Penterman, J., Choi, Y., Harada, J. J., Goldberg, R. B., Fischer, R. L. D. E. M. E. T. E. R. DNA glycosylase establishes MEDEA polycomb gene self-imprinting by allele-specific demethylation. Cell. 124, 495-506 (2006).
- Henderson, I. R., Chan, S. R., Cao, X., Johnson, L., Jacobsen, S. E. Accurate sodium bisulfite sequencing in plants. Epigenetics. 5, 47-49 (2010).
- Hsieh, T. F., Ibarra, C. A., Silva, P., Zemach, A., Eshed-Williams, L., Fischer, R. L., Zilberman, D. Genome-wide demethylation of Arabidopsis endosperm. Science. 324, 1451-1454 (2009).
- Jacobsen, S. E., Sakai, H., Finnegan, E. J., Cao, X., Meyerowitz, E. M. Ectopic hypermethylation of flower-specific genes in Arabidopsis. Curr. Biol. 10, 179-186 (2000).
- Kinoshita, T., Miura, A., Choi, Y., Kinoshita, Y., Cao, X., Jacobsen, S. E., Fischer, R. L., Kakutani, T. One-way control of FWA imprinting in Arabidopsis endosperm by DNA methylation. Science. 303, 521-523 (2004).
- Lister, R., O’Malley, R. C., Tonti-Filippini, J., Gregory, B. D., Berry, C. C., Millar, A. H., Ecker, J. R. Highly integrated single-base resolution maps of the epigenome in Arabidopsis. Cell. 133, 523-536 (2008).
- Lister, R., Pelizzola, M., Dowen, R. H., Hawkins, R. D., Hon, G., Tonti-Filippini, J., Nery, J. R., Lee, L., Ye, Z., Ngo, Q. -. M. Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences. Nature. 462, 315-322 (2009).
- Paulin, R., Grigg, G. W., Davey, M. W., Piper, A. A. Urea improves efficiency of bisulfite-mediated sequencing of 5′- methylcytosine in genomic DNA. Nucl. Acids Res. 26, 5009-5010 (1998).
- Rogers, S. O., &, B. e. n. d. i. c. h., J, A. Extraction of DNA from plant tissues. Plant Molecular Biology Manual. A6, 1-10 (1988).
- Smyth, D. R., Bowman, J. L., Elliot, M., Meyerowitz, E. M. Early Flower Development in Arabídopsis. Plant Cell. 2, 755-767 (1990).
- Xiao, W., Gehring, M., Choi, Y., Margossian, L., Pu, H., Harada, J. J., Goldberg, R. B., Pennell, R. I., Fischer, R. L. Imprinting of the MEA Polycomb gene is controlled by antagonism between MET1 methyltransferase and DME glycosylase. Dev. Cell. 5, 891-901 (2003).
