Détermination de méthylation de l'ADN des gènes soumis à empreinte dans les Arabidopsis Endosperme
Summary
L'imprinting est un phénomène dans l'usine et la reproduction des mammifères. Méthylation de l'ADN joue un rôle important dans les mécanismes de l'empreinte. Isoler l'endosperme et la détermination du statut de méthylation de gènes soumis à empreinte dans les<em> Arabidopsis</em> Il peut être difficile. Dans ce protocole, nous décrivons comment isoler l'albumen et de déterminer la méthylation par séquençage au bisulfite.
Abstract
Arabidopsis thaliana est un organisme excellent modèle pour étudier les mécanismes épigénétiques. Une des raisons est le mutant nul de perte de fonction de l'ADN méthyltransférases est viable, offrant ainsi un système à étudier comment la perte de méthylation de l'ADN dans un génome influe sur la croissance et le développement. Impression se réfère à l'expression différentielle des allèles maternels et paternels et joue un rôle important dans le développement de la reproduction dans les deux mammifères et les plantes. Méthylation de l'ADN est essentielle pour déterminer si les allèles maternels ou paternels d'un gène est exprimé ou imprimé au silence. Dans les plantes à fleurs, il ya un événement double fécondation de la reproduction: un spermatozoïde fertilise l'ovule pour former l'embryon et un spermatozoïde fusionne avec la seconde cellule centrale pour donner naissance à l'albumen. Endosperme est le tissu où se produit l'empreinte dans les plantes. MEDEA, un domaine SET gènes du groupe Polycomb et FWA, un facteur de transcription régulant la floraison, sont les deux premiers gènes soumis à empreinte montré dans l'endosperme et de leur expression est contrôlée par méthylation de l'ADN et la déméthylation de plantes. Afin de déterminer le statut de l'empreinte d'un gène et le modèle de méthylation dans l'albumen, nous devons être en mesure d'isoler l'albumen premier. Depuis semence est petite chez Arabidopsis, il reste difficile d'isoler l'albumen Arabidopsis et examiner sa méthylation. Dans ce protocole vidéo, nous présentons la façon de mener un croisement génétique, afin d'isoler albumen de graines, et de déterminer le statut de méthylation par séquençage au bisulfite.
Protocol
Discussion
Il est relativement facile de séparer embryon à partir de l'endosperme et tégument, mais il est fastidieux de séparer l'endosperme du tégument, en particulier pour les semences à un stade précoce ou à mi-torpilles de l'embryogenèse. Depuis tégument ne contribue qu'à une très petite quantité de tissu, pour certains gènes, par exemple, la MEA et FWA, nous n'avons pas de séparer l'endosperme du tégument. Cela signifie que nous pouvons isoler les ARN à partir d'…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Mme Jennifer M. Lommel et Tara N. Rognan pour l'entretien des plantes d'Arabidopsis. Ce travail a été soutenu par des fonds de démarrage de Saint Louis University et National Institutes of Health subventions 1R15GM086846-01 et 3R15GM086846-01S1 à W. Xiao.
Materials
Supplies
- Dissecting Microscope
- Scissors
- Fine Tip Forceps
- Jewelry Tag
- Plant Stakes
- String or Twist-Ties
- 4″ X 2″ X 8″ Polyethylene Bags
- 3″ X 1″ X 1.0 mm Microscope Slides
- Liquid Nitrogen
- Liquid Nitrogen Containers
- Heat Block
- PCR Tubes
- Thermocycler
- Microcentrifuge Tubes
- Microcentrifuge
- Gel Electrophoresis facility
- Arabidopsis thaliana Columbia-0 Plants
- Arabidopsis thaliana Landsberg erecta Plants
Reagents
- 70% Ethanol
- 95% Ethanol
- 100% Ethanol
- 0.3 M Sorbitol and 5 mM MES-pH 5.7
- Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB)
- 100% Ethanol
- Cholorform
- Restriction Enzymes
- 3 M NaOH
- 6.3 M NaOH
- 6.24 M Urea/ 4 M Sodium Bisulfite
- Sterile distilled H2O
- 10 mM Hydroquinone
- Wizard DNA Clean-Up System (Promega)
- 10 M NH4OAc
- 20 μg/ μL tRNA
- TE buffer
- The TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)
Riferimenti
- Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).
- Cokus, S. J., Feng, S., Zhang, X., Chen, Z., Merriman, B., Haudenschild, C. D., Sriharsa Pradhan, S., Nelson, S. F., Pellegrini, M., Jacobsen, S. E. Shotgun bisulphite sequencing of the Arabidopsis genome reveals DNA methylation patterning. Nature. 452, 215-219 (2008).
- Frommer, M., McDonald, L. E., Millar, D. S., Collis, C. M., Watt, F., Grigg, G. W. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc Natl Acad Sci USA. 89, 1827-1831 (1992).
- Gehring, M., Huh, J. H., Hsieh, T. F., Penterman, J., Choi, Y., Harada, J. J., Goldberg, R. B., Fischer, R. L. D. E. M. E. T. E. R. DNA glycosylase establishes MEDEA polycomb gene self-imprinting by allele-specific demethylation. Cell. 124, 495-506 (2006).
- Henderson, I. R., Chan, S. R., Cao, X., Johnson, L., Jacobsen, S. E. Accurate sodium bisulfite sequencing in plants. Epigenetics. 5, 47-49 (2010).
- Hsieh, T. F., Ibarra, C. A., Silva, P., Zemach, A., Eshed-Williams, L., Fischer, R. L., Zilberman, D. Genome-wide demethylation of Arabidopsis endosperm. Science. 324, 1451-1454 (2009).
- Jacobsen, S. E., Sakai, H., Finnegan, E. J., Cao, X., Meyerowitz, E. M. Ectopic hypermethylation of flower-specific genes in Arabidopsis. Curr. Biol. 10, 179-186 (2000).
- Kinoshita, T., Miura, A., Choi, Y., Kinoshita, Y., Cao, X., Jacobsen, S. E., Fischer, R. L., Kakutani, T. One-way control of FWA imprinting in Arabidopsis endosperm by DNA methylation. Science. 303, 521-523 (2004).
- Lister, R., O’Malley, R. C., Tonti-Filippini, J., Gregory, B. D., Berry, C. C., Millar, A. H., Ecker, J. R. Highly integrated single-base resolution maps of the epigenome in Arabidopsis. Cell. 133, 523-536 (2008).
- Lister, R., Pelizzola, M., Dowen, R. H., Hawkins, R. D., Hon, G., Tonti-Filippini, J., Nery, J. R., Lee, L., Ye, Z., Ngo, Q. -. M. Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences. Nature. 462, 315-322 (2009).
- Paulin, R., Grigg, G. W., Davey, M. W., Piper, A. A. Urea improves efficiency of bisulfite-mediated sequencing of 5′- methylcytosine in genomic DNA. Nucl. Acids Res. 26, 5009-5010 (1998).
- Rogers, S. O., &, B. e. n. d. i. c. h., J, A. Extraction of DNA from plant tissues. Plant Molecular Biology Manual. A6, 1-10 (1988).
- Smyth, D. R., Bowman, J. L., Elliot, M., Meyerowitz, E. M. Early Flower Development in Arabídopsis. Plant Cell. 2, 755-767 (1990).
- Xiao, W., Gehring, M., Choi, Y., Margossian, L., Pu, H., Harada, J. J., Goldberg, R. B., Pennell, R. I., Fischer, R. L. Imprinting of the MEA Polycomb gene is controlled by antagonism between MET1 methyltransferase and DME glycosylase. Dev. Cell. 5, 891-901 (2003).
