Bepaling van de DNA-methylatie van genen in Imprinted Arabidopsis Endosperm
Summary
Imprinting is een fenomeen in plant en zoogdier reproductie. DNA-methylatie speelt een belangrijke rol in de mechanismen van imprinting. Isoleren endosperm en het bepalen van methylatie status van de ingeprente genen in<em> Arabidopsis</em> Kan moeilijk zijn. In dit protocol beschrijven we hoe de endosperm isoleren en te bepalen door de methylatie bisulfiet sequencing.
Abstract
Arabidopsis thaliana is een uitstekend modelorganisme voor het bestuderen van epigenetische mechanismen. Een van de redenen is het verlies-van-functie null mutant van DNA-methyl-levensvatbaar is, en zo een systeem om te bestuderen hoe het verlies van DNA-methylatie in een genoom van invloed op de groei en ontwikkeling. Imprinting verwijst naar de differentiële expressie van de moederlijke en vaderlijke allelen en speelt een belangrijke rol bij de voortplanting ontwikkeling in zowel zoogdieren en planten. DNA-methylatie is van cruciaal belang voor het bepalen van de vraag of de moeders-of vaderskant allelen van een gen ingeprent is uitgedrukt of het zwijgen opgelegd. In bloeiende planten, is er een dubbele bevruchting gebeurtenis in de voortplanting: een zaadcel bevrucht de eicel naar embryo en een tweede zaadcel zekeringen formulier met de centrale cel aanleiding kan geven tot endosperm. Endosperm is het weefsel waar de inprenting voorkomt in planten. MEDEA, een SET-domeinnaam Polycomb groep gen, en FWA, een transcriptiefactor regulerende bloei, zijn de eerste twee genen aangetoond dat bedrukt in endosperm en hun expressie wordt gecontroleerd door DNA-methylering en demethylering in planten. Met het oog op imprinting status van een gen en methylatie patroon in endosperm te bepalen, moeten we in staat zijn om eerst te isoleren endosperm. Omdat zaad is klein in Arabidopsis, blijft het een uitdaging om Arabidopsis endosperm isoleren en de methylatie te onderzoeken. In deze video protocol, rapporteren we hoe een genetische kruis te voeren, om endosperm weefsel te isoleren uit zaden, en naar de methylatiestatus bepalen bisulfiet sequencing.
Protocol
Discussion
Het is relatief eenvoudig om embryo's te scheiden van het endosperm en de zaadhuid, maar het is vervelend om endosperm scheiden van zaadhuid, vooral voor zaden in een vroeg of midden-torpedo stadium van de embryogenese. Omdat zaadhuid alleen bij een zeer kleine hoeveelheid weefsel, voor sommige genen, bijvoorbeeld, MEA en de FWA, hoeven we niet te endosperm scheiden van zaadhuid. Dat betekent dat we kunnen isoleren RNA's uit een mengsel van endosperm en zaadhuid weefsels, controleer dan de expr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs danken mevrouw Jennifer M. Lommel en Tara N. Rognan voor het onderhoud van Arabidopsis-planten. Dit werk werd ondersteund door start-up fondsen van Saint Louis University en de National Institutes of Health beurzen 1R15GM086846-01 en 3R15GM086846-01S1 aan W. Xiao.
Materials
Supplies
- Dissecting Microscope
- Scissors
- Fine Tip Forceps
- Jewelry Tag
- Plant Stakes
- String or Twist-Ties
- 4″ X 2″ X 8″ Polyethylene Bags
- 3″ X 1″ X 1.0 mm Microscope Slides
- Liquid Nitrogen
- Liquid Nitrogen Containers
- Heat Block
- PCR Tubes
- Thermocycler
- Microcentrifuge Tubes
- Microcentrifuge
- Gel Electrophoresis facility
- Arabidopsis thaliana Columbia-0 Plants
- Arabidopsis thaliana Landsberg erecta Plants
Reagents
- 70% Ethanol
- 95% Ethanol
- 100% Ethanol
- 0.3 M Sorbitol and 5 mM MES-pH 5.7
- Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB)
- 100% Ethanol
- Cholorform
- Restriction Enzymes
- 3 M NaOH
- 6.3 M NaOH
- 6.24 M Urea/ 4 M Sodium Bisulfite
- Sterile distilled H2O
- 10 mM Hydroquinone
- Wizard DNA Clean-Up System (Promega)
- 10 M NH4OAc
- 20 μg/ μL tRNA
- TE buffer
- The TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)
Riferimenti
- Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).
- Cokus, S. J., Feng, S., Zhang, X., Chen, Z., Merriman, B., Haudenschild, C. D., Sriharsa Pradhan, S., Nelson, S. F., Pellegrini, M., Jacobsen, S. E. Shotgun bisulphite sequencing of the Arabidopsis genome reveals DNA methylation patterning. Nature. 452, 215-219 (2008).
- Frommer, M., McDonald, L. E., Millar, D. S., Collis, C. M., Watt, F., Grigg, G. W. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc Natl Acad Sci USA. 89, 1827-1831 (1992).
- Gehring, M., Huh, J. H., Hsieh, T. F., Penterman, J., Choi, Y., Harada, J. J., Goldberg, R. B., Fischer, R. L. D. E. M. E. T. E. R. DNA glycosylase establishes MEDEA polycomb gene self-imprinting by allele-specific demethylation. Cell. 124, 495-506 (2006).
- Henderson, I. R., Chan, S. R., Cao, X., Johnson, L., Jacobsen, S. E. Accurate sodium bisulfite sequencing in plants. Epigenetics. 5, 47-49 (2010).
- Hsieh, T. F., Ibarra, C. A., Silva, P., Zemach, A., Eshed-Williams, L., Fischer, R. L., Zilberman, D. Genome-wide demethylation of Arabidopsis endosperm. Science. 324, 1451-1454 (2009).
- Jacobsen, S. E., Sakai, H., Finnegan, E. J., Cao, X., Meyerowitz, E. M. Ectopic hypermethylation of flower-specific genes in Arabidopsis. Curr. Biol. 10, 179-186 (2000).
- Kinoshita, T., Miura, A., Choi, Y., Kinoshita, Y., Cao, X., Jacobsen, S. E., Fischer, R. L., Kakutani, T. One-way control of FWA imprinting in Arabidopsis endosperm by DNA methylation. Science. 303, 521-523 (2004).
- Lister, R., O’Malley, R. C., Tonti-Filippini, J., Gregory, B. D., Berry, C. C., Millar, A. H., Ecker, J. R. Highly integrated single-base resolution maps of the epigenome in Arabidopsis. Cell. 133, 523-536 (2008).
- Lister, R., Pelizzola, M., Dowen, R. H., Hawkins, R. D., Hon, G., Tonti-Filippini, J., Nery, J. R., Lee, L., Ye, Z., Ngo, Q. -. M. Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences. Nature. 462, 315-322 (2009).
- Paulin, R., Grigg, G. W., Davey, M. W., Piper, A. A. Urea improves efficiency of bisulfite-mediated sequencing of 5′- methylcytosine in genomic DNA. Nucl. Acids Res. 26, 5009-5010 (1998).
- Rogers, S. O., &, B. e. n. d. i. c. h., J, A. Extraction of DNA from plant tissues. Plant Molecular Biology Manual. A6, 1-10 (1988).
- Smyth, D. R., Bowman, J. L., Elliot, M., Meyerowitz, E. M. Early Flower Development in Arabídopsis. Plant Cell. 2, 755-767 (1990).
- Xiao, W., Gehring, M., Choi, Y., Margossian, L., Pu, H., Harada, J. J., Goldberg, R. B., Pennell, R. I., Fischer, R. L. Imprinting of the MEA Polycomb gene is controlled by antagonism between MET1 methyltransferase and DME glycosylase. Dev. Cell. 5, 891-901 (2003).
