のインプリント遺伝子のDNAメチル化の定量シロイヌナズナ胚乳
Summary
刷り込みは、植物と哺乳類の生殖の現象です。 DNAメチル化はインプリンティングのメカニズムに重要な役割を果たしている。胚乳を分離し、でインプリント遺伝子のメチル化状態を決定する<em>シロイヌナズナ</em>困難になる可能性があります。このプロトコルでは、我々は、胚乳を分離し、バイサルファイトシークエンシングによってメチル化を決定する方法について説明します。
Abstract
シロイヌナズナでは、エピジェネティックなメカニズムを研究するための優れたモデル生物である。理由の一つは、DNAメチルトランスフェラーゼの機能喪失型のヌル変異体であるため、ゲノムのDNAメチル化の消失は、成長と発展にどのように影響するかを研究するシステムを提供し、実行可能です。刷り込みは、母親と父親の対立遺伝子の差次的発現を意味し、哺乳類や植物の両方で再生開発において重要な役割を果たしている。 DNAメチル化はインプリント遺伝子の母性や父性の対立遺伝子が発現したり、沈黙されているかどうかを決定するための非常に重要です。顕花植物では、生殖における重複受精のイベントがあります：一つ精子細胞は、胚乳を生じさせるために、中央細胞と胚と第二精子のヒューズを形成するために卵細胞を受精。胚乳は、刷り込みが植物に発生した組織です。MEDEA、SETドメインポリコーム群遺伝子、及びFWA、開花を調節する転写因子は、胚乳およびそれらの発現にプリントにして表示された最初の2つの遺伝子であるにDNAメチル化と脱メチル化によって制御される植物。胚乳の遺伝子とメチル化パターンの刷り込みの状態を決定するために、我々は最初の胚乳を分離できるようにする必要があります。シードは、 シロイヌナズナの小さななので、それはシロイヌナズナ胚乳を分離し、そのメチル化を調べることが困難なままである。このビデオプロトコルでは、我々は、遺伝的交雑を実施するために種子から胚乳組織を分離するために、そして、重亜硫酸塩シークエンシングによりメチル化状態を判別する方法を報告する。
Protocol
Discussion
それは、胚乳と種皮から胚を分離することは比較的容易ですが、それは胚発生の初期または中期魚雷の段階で、特に種子のために、種皮から胚乳を分離することは面倒です。種皮のみを組織のごく少量を寄与するため、いくつかの遺伝子については、例えば、MEAとFWAは 、我々は種皮から胚乳を分離する必要はありません。我々は胚乳と種皮の組織の混合物からRNAを分離できるこ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、 シロイヌナズナ植物のメンテナンスのために氏ジェニファーM.ロンメルとタラN. Rognanに感謝。この作品は、健康補助1R15GM086846 – 01とW ·シャオに3R15GM086846 – 01S1のセントルイス大学と国立研究所からの起動資金によってサポートされていました。
Materials
Supplies
- Dissecting Microscope
- Scissors
- Fine Tip Forceps
- Jewelry Tag
- Plant Stakes
- String or Twist-Ties
- 4″ X 2″ X 8″ Polyethylene Bags
- 3″ X 1″ X 1.0 mm Microscope Slides
- Liquid Nitrogen
- Liquid Nitrogen Containers
- Heat Block
- PCR Tubes
- Thermocycler
- Microcentrifuge Tubes
- Microcentrifuge
- Gel Electrophoresis facility
- Arabidopsis thaliana Columbia-0 Plants
- Arabidopsis thaliana Landsberg erecta Plants
Reagents
- 70% Ethanol
- 95% Ethanol
- 100% Ethanol
- 0.3 M Sorbitol and 5 mM MES-pH 5.7
- Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB)
- 100% Ethanol
- Cholorform
- Restriction Enzymes
- 3 M NaOH
- 6.3 M NaOH
- 6.24 M Urea/ 4 M Sodium Bisulfite
- Sterile distilled H2O
- 10 mM Hydroquinone
- Wizard DNA Clean-Up System (Promega)
- 10 M NH4OAc
- 20 μg/ μL tRNA
- TE buffer
- The TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)
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