Bestimmung der DNA-Methylierung von geprägten Genen in Arabidopsis Endosperm
Summary
Imprinting ist ein Phänomen in Pflanzen-und Säugetier Reproduktion. DNA-Methylierung spielt eine wichtige Rolle in Mechanismen der Prägung. Isolating Endosperm und Bestimmung Methylierungsstatus von geprägten Genen in<em> Arabidopsis</em> Kann schwierig sein. In diesem Protokoll, beschreiben wir, wie Endosperm isolieren und zu bestimmen Methylierung durch Bisulfit-Sequenzierung.
Abstract
Arabidopsis thaliana ist ein hervorragendes Modell-Organismus für die Untersuchung epigenetischen Mechanismen. Einer der Gründe ist der Verlust-of-function Nullmutante von DNA-Methyltransferasen lebensfähig ist, so dass ein System zu untersuchen, wie Verlust von DNA-Methylierung in einem Genom beeinflusst Wachstum und Entwicklung. Imprinting bezeichnet differentielle Expression von mütterlichen und väterlichen Allelen und spielt eine wichtige Rolle bei der Fortpflanzung Entwicklung in beiden Säugetier-und Pflanzenarten. DNA-Methylierung ist entscheidend dafür, ob die mütterliche oder väterliche Allele eines aufgedruckten Gen exprimiert wird oder zum Schweigen gebracht. In Blütenpflanzen gibt es eine doppelte Befruchtung bei der Reproduktion: eine Samenzelle befruchtet die Eizelle zum Embryo und einem zweiten Spermien Sicherungen mit der zentralen Zelle zu steigen, um Endosperm Form geben. Endosperm ist das Gewebe, in dem Imprinting tritt in Pflanzen. MEDEA, ein SET-Domäne Polycomb Gruppe Gen und FWA, ein Transkriptionsfaktor Regulierung der Blüte sind die ersten beiden Gene gezeigt, dass in Endosperm und ihren Ausdruck geprägt wird durch DNA-Methylierung und Demethylierung in kontrollierten Pflanzen. Um Imprinting-Status eines Gens und Methylierungsmuster in Endosperm zu bestimmen, müssen wir in der Lage sein Endosperm zunächst zu isolieren. Da Samen ist winzig in Arabidopsis, bleibt es schwierig, Arabidopsis Endosperm isolieren und untersuchen ihre Methylierung. In diesem Video-Protokoll, berichten wir, wie man eine genetische Kreuz zu führen, um Endospermgewebe aus Samen zu isolieren und den Methylierungsstatus von Bisulfit-Sequenzierung zu ermitteln.
Protocol
Discussion
Es ist relativ leicht zu Embryo aus Endosperm und Samenschale getrennt, aber es ist mühsam, Endosperm von Samenschale trennen, vor allem für Saatgut auf Anfang oder Mitte-Torpedo Stadium der Embryogenese. Da Samenschale trägt nur eine sehr kleine Menge an Gewebe, für einige Gene, z. B., MEA und FWA, haben wir nicht zu Endosperm von Samenschale zu trennen. Das heißt, wir können RNAs aus einer Mischung von Endosperm und Samenschale Gewebe zu isolieren, zu überprüfen Ausdruck des mütterlichen und…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Frau Jennifer M. Lommel und Tara N. Rognan für die Wartung von Arabidopsis-Pflanzen. Diese Arbeit wurde durch eine Anschubfinanzierung von Saint Louis University und National Institutes of Health gewährt 1R15GM086846-01 und 3R15GM086846-01S1 zu W. Xiao unterstützt.
Materials
Supplies
- Dissecting Microscope
- Scissors
- Fine Tip Forceps
- Jewelry Tag
- Plant Stakes
- String or Twist-Ties
- 4″ X 2″ X 8″ Polyethylene Bags
- 3″ X 1″ X 1.0 mm Microscope Slides
- Liquid Nitrogen
- Liquid Nitrogen Containers
- Heat Block
- PCR Tubes
- Thermocycler
- Microcentrifuge Tubes
- Microcentrifuge
- Gel Electrophoresis facility
- Arabidopsis thaliana Columbia-0 Plants
- Arabidopsis thaliana Landsberg erecta Plants
Reagents
- 70% Ethanol
- 95% Ethanol
- 100% Ethanol
- 0.3 M Sorbitol and 5 mM MES-pH 5.7
- Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB)
- 100% Ethanol
- Cholorform
- Restriction Enzymes
- 3 M NaOH
- 6.3 M NaOH
- 6.24 M Urea/ 4 M Sodium Bisulfite
- Sterile distilled H2O
- 10 mM Hydroquinone
- Wizard DNA Clean-Up System (Promega)
- 10 M NH4OAc
- 20 μg/ μL tRNA
- TE buffer
- The TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)
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