Baskılı Genler DNA metilasyon Belirlenmesi Arabidopsis Endosperm
Summary
Basma, bitki ve memeli üreme bir olgudur. DNA metilasyon, imprinting mekanizmaları önemli bir rol oynar. Endosperm Yalıtımlı ve baskılı genlerinin metilasyon durumunun belirlenmesinde<em> Arabidopsis</em> Zor olabilir. Bu protokol, endosperm izole ve metilasyon bisülfit sıralama tarafından nasıl belirleneceği açıklanmaktadır.
Abstract
Arabidopsis thaliana epigenetik mekanizmalar çalışmak için mükemmel bir model organizmadır. Nedenlerinden biri DNA methyltransferases kaybı fonksiyon-boş mutant böylece bir genom DNA metilasyon kaybı, büyüme ve gelişme nasıl etkilediğini incelemek için bir sistem sağlayarak, yaşayabilir. Basma maternal ve paternal allellerin diferansiyel ifadesi anlamına gelir ve hem de memeli hayvan ve bitkilerin üreme gelişmesinde önemli bir rol oynar. DNA metilasyon baskılı bir gen anne veya baba allel ifade ya da susturulmuş olup olmadığını belirlemek için kritik öneme sahiptir. Çiçekli bitkiler, bir çift üreme döllenme olayı var: tek bir sperm hücresi yumurta hücresi embriyo ve endosperm yol vermek için merkezi bir hücre ile ikinci bir sperm sigortalar oluşturmak için döller. Endospermi imprinting, bitkilerde meydana gelen bir dokudur. MEDEA, bir SET etki Polycomb grup gen, FWA, çiçekli düzenleyen bir transkripsiyon faktörü, endosperm ve kendi ifade baskılı gösterilen ilk iki gen, DNA metilasyon ve demetilasyon tarafından kontrol edilir bitkiler. Bir gen ve endosperm metilasyon paterni imprinting durumunu belirlemek amacıyla, ilk endosperm izole etmek gerekir. Tohum Arabidopsis ufak olduğundan, Arabidopsis endosperm izole ve metilasyon incelemek için zorlu kalır. Bu video protokolde, tohumları endosperm doku izole etmek için, genetik bir çapraz yapmak ve bisülfit sıralama metilasyon durumunu belirlemek için nasıl rapor.
Protocol
Discussion
Embriyo, endosperm ve tohum kabuğu ayırmak için nispeten kolaydır, ancak embriyogenez erken veya orta-torpido aşamada özellikle tohum tohum kabuğu, endosperm ayrı sıkıcı. Tohum kabuğu, sadece bazı genler için çok küçük bir miktar doku katkıda bulunmasından dolayı, örneğin, MEA ve FWA, endosperm, tohum kabuğu ayırmak zorunda değilsiniz. Endosperm ve tohum kat dokularda oluşan bir karışım RNA'lar tecrit anlamına gelir ki, bir genin anne ve baba allel ifade, embriyo ifad…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Arabidopsis bitkilerin bakımı için Bayan Jennifer M. Lommel ve Tara N. Rognan teşekkür ederim. Bu çalışma, Saint Louis Üniversitesi ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Sağlık hibe 1R15GM086846-01 ve 3R15GM086846-01S1 W. Xiao başlangıç fonu tarafından desteklenmiştir.
Materials
Supplies
- Dissecting Microscope
- Scissors
- Fine Tip Forceps
- Jewelry Tag
- Plant Stakes
- String or Twist-Ties
- 4″ X 2″ X 8″ Polyethylene Bags
- 3″ X 1″ X 1.0 mm Microscope Slides
- Liquid Nitrogen
- Liquid Nitrogen Containers
- Heat Block
- PCR Tubes
- Thermocycler
- Microcentrifuge Tubes
- Microcentrifuge
- Gel Electrophoresis facility
- Arabidopsis thaliana Columbia-0 Plants
- Arabidopsis thaliana Landsberg erecta Plants
Reagents
- 70% Ethanol
- 95% Ethanol
- 100% Ethanol
- 0.3 M Sorbitol and 5 mM MES-pH 5.7
- Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB)
- 100% Ethanol
- Cholorform
- Restriction Enzymes
- 3 M NaOH
- 6.3 M NaOH
- 6.24 M Urea/ 4 M Sodium Bisulfite
- Sterile distilled H2O
- 10 mM Hydroquinone
- Wizard DNA Clean-Up System (Promega)
- 10 M NH4OAc
- 20 μg/ μL tRNA
- TE buffer
- The TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)
Riferimenti
- Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).
- Cokus, S. J., Feng, S., Zhang, X., Chen, Z., Merriman, B., Haudenschild, C. D., Sriharsa Pradhan, S., Nelson, S. F., Pellegrini, M., Jacobsen, S. E. Shotgun bisulphite sequencing of the Arabidopsis genome reveals DNA methylation patterning. Nature. 452, 215-219 (2008).
- Frommer, M., McDonald, L. E., Millar, D. S., Collis, C. M., Watt, F., Grigg, G. W. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc Natl Acad Sci USA. 89, 1827-1831 (1992).
- Gehring, M., Huh, J. H., Hsieh, T. F., Penterman, J., Choi, Y., Harada, J. J., Goldberg, R. B., Fischer, R. L. D. E. M. E. T. E. R. DNA glycosylase establishes MEDEA polycomb gene self-imprinting by allele-specific demethylation. Cell. 124, 495-506 (2006).
- Henderson, I. R., Chan, S. R., Cao, X., Johnson, L., Jacobsen, S. E. Accurate sodium bisulfite sequencing in plants. Epigenetics. 5, 47-49 (2010).
- Hsieh, T. F., Ibarra, C. A., Silva, P., Zemach, A., Eshed-Williams, L., Fischer, R. L., Zilberman, D. Genome-wide demethylation of Arabidopsis endosperm. Science. 324, 1451-1454 (2009).
- Jacobsen, S. E., Sakai, H., Finnegan, E. J., Cao, X., Meyerowitz, E. M. Ectopic hypermethylation of flower-specific genes in Arabidopsis. Curr. Biol. 10, 179-186 (2000).
- Kinoshita, T., Miura, A., Choi, Y., Kinoshita, Y., Cao, X., Jacobsen, S. E., Fischer, R. L., Kakutani, T. One-way control of FWA imprinting in Arabidopsis endosperm by DNA methylation. Science. 303, 521-523 (2004).
- Lister, R., O’Malley, R. C., Tonti-Filippini, J., Gregory, B. D., Berry, C. C., Millar, A. H., Ecker, J. R. Highly integrated single-base resolution maps of the epigenome in Arabidopsis. Cell. 133, 523-536 (2008).
- Lister, R., Pelizzola, M., Dowen, R. H., Hawkins, R. D., Hon, G., Tonti-Filippini, J., Nery, J. R., Lee, L., Ye, Z., Ngo, Q. -. M. Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences. Nature. 462, 315-322 (2009).
- Paulin, R., Grigg, G. W., Davey, M. W., Piper, A. A. Urea improves efficiency of bisulfite-mediated sequencing of 5′- methylcytosine in genomic DNA. Nucl. Acids Res. 26, 5009-5010 (1998).
- Rogers, S. O., &, B. e. n. d. i. c. h., J, A. Extraction of DNA from plant tissues. Plant Molecular Biology Manual. A6, 1-10 (1988).
- Smyth, D. R., Bowman, J. L., Elliot, M., Meyerowitz, E. M. Early Flower Development in Arabídopsis. Plant Cell. 2, 755-767 (1990).
- Xiao, W., Gehring, M., Choi, Y., Margossian, L., Pu, H., Harada, J. J., Goldberg, R. B., Pennell, R. I., Fischer, R. L. Imprinting of the MEA Polycomb gene is controlled by antagonism between MET1 methyltransferase and DME glycosylase. Dev. Cell. 5, 891-901 (2003).
