Determinazione della metilazione del DNA di geni impressa Arabidopsis Dell'endosperma

Summary

L'imprinting è un fenomeno in impianti e riproduzione dei mammiferi. Metilazione del DNA gioca un ruolo importante nei meccanismi di imprinting. Isolando endosperma e determinare lo stato di metilazione dei geni impressa<em> Arabidopsis</em> Può essere difficile. In questo protocollo, si descrive come isolare endosperma e determinare metilazione mediante sequenziamento bisolfito.

Abstract

Arabidopsis thaliana è un organismo modello eccellente per lo studio dei meccanismi epigenetici. Uno dei motivi è la perdita di funzione mutante nullo di DNA metiltransferasi è vitale, fornendo così un sistema per studiare come la perdita di metilazione del DNA in un genoma influisce sulla crescita e lo sviluppo. Imprinting si riferisce alla espressione differenziale di alleli paterni e materni e svolge un ruolo importante nello sviluppo riproduzione in entrambi i mammiferi e piante. Metilazione del DNA è essenziale per determinare se gli alleli materni o paterni di un gene impresso è espressa o tacere. In piante da fiore, c'è un evento doppia fecondazione in riproduzione: una cellula spermatozoo feconda l'ovulo per formare embrione e un fusibili sperma secondo con la cella centrale per dar luogo a endosperma. Endosperma è il tessuto in cui imprinting si verifica nelle piante. MEDEA, un dominio gene SET Polycomb gruppo e FWA, un fattore di trascrizione che regolano la fioritura, sono i primi due geni dimostrato di essere impressa nella endosperma e la loro espressione è controllata da metilazione del DNA e demetilazione in piante. Al fine di determinare lo stato imprinting di un gene e pattern di metilazione in endosperma, dobbiamo essere in grado di isolare endosperma prima. Dal seme è piccolo in Arabidopsis, rimane difficile da isolare endosperma Arabidopsis ed esaminare la sua metilazione. In questo protocollo video, si segnala come condurre un incrocio, per isolare il tessuto dell'endosperma da semi, e per determinare lo stato di metilazione mediante sequenziamento bisolfito.

Protocol

I. genetica Crossing 1. Castrante il genitore femmina Al fine di distinguere gli alleli materni e paterni, utilizzando sequenza polimorfismo del DNA, due ecotipi diversi, ad esempio, la Columbia-0 (Col-0) e Ler, saranno scelti come genitori femminile e maschile. Le piante devono essere giovani e sani. Si può evirare il genitore femminile utilizzando un microscopio da dissezione, visiera d'ingrandimento, o occhio nudo. Individuare fase-12 fiori (Smyth et al.,<…

Discussion

E 'relativamente facile separare embrione da endosperma e tegumento, ma è noioso per separare endosperma da tegumento, soprattutto per le sementi in fase iniziale o medio-siluro di embriogenesi. Dal cappotto di seme contribuisce solo una piccola quantità di tessuto, per alcuni geni, ad esempio, MEA e FWA, non abbiamo a separare endosperma da tegumento. Questo significa che siamo in grado di isolare RNA da una miscela di endosperma e tessuti tegumento, controllare l'espressione degli alleli ma…

Materials

Supplies

• Dissecting Microscope
• Scissors
• Fine Tip Forceps
• Jewelry Tag
• Plant Stakes
• String or Twist-Ties
• 4″ X 2″ X 8″ Polyethylene Bags
• 3″ X 1″ X 1.0 mm Microscope Slides
• Liquid Nitrogen
• Liquid Nitrogen Containers
• Heat Block
• PCR Tubes
• Thermocycler
• Microcentrifuge Tubes
• Microcentrifuge
• Gel Electrophoresis facility
• Arabidopsis thaliana Columbia-0 Plants
• Arabidopsis thaliana Landsberg erecta Plants

Reagents

• 70% Ethanol
• 95% Ethanol
• 100% Ethanol
• 0.3 M Sorbitol and 5 mM MES-pH 5.7
• Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB)
• 100% Ethanol
• Cholorform
• Restriction Enzymes
• 3 M NaOH
• 6.3 M NaOH
• 6.24 M Urea/ 4 M Sodium Bisulfite
• Sterile distilled H₂O
• 10 mM Hydroquinone
• Wizard DNA Clean-Up System (Promega)
• 10 M NH₄OAc
• 20 μg/ μL tRNA
• TE buffer
• The TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)