L'imprinting è un fenomeno in impianti e riproduzione dei mammiferi. Metilazione del DNA gioca un ruolo importante nei meccanismi di imprinting. Isolando endosperma e determinare lo stato di metilazione dei geni impressa Arabidopsis Può essere difficile. In questo protocollo, si descrive come isolare endosperma e determinare metilazione mediante sequenziamento bisolfito.
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Articolo metodologico
Determinazione della metilazione del DNA di geni impressa Arabidopsis Dell'endosperma
In questo articolo
Sommario
Abstract
Arabidopsis thaliana è un organismo modello eccellente per lo studio dei meccanismi epigenetici. Uno dei motivi è la perdita di funzione mutante nullo di DNA metiltransferasi è vitale, fornendo così un sistema per studiare come la perdita di metilazione del DNA in un genoma influisce sulla crescita e lo sviluppo. Imprinting si riferisce alla espressione differenziale di alleli paterni e materni e svolge un ruolo importante nello sviluppo riproduzione in entrambi i mammiferi e piante. Metilazione del DNA è essenziale per determinare se gli alleli materni o paterni di un gene impresso è espressa o tacere. In piante da fiore, c'è un evento doppia fecondazione in riproduzione: una cellula spermatozoo feconda l'ovulo per formare embrione e un fusibili sperma secondo con la cella centrale per dar luogo a endosperma. Endosperma è il tessuto in cui imprinting si verifica nelle piante. MEDEA, un dominio gene SET Polycomb gruppo e FWA, un fattore di trascrizione che regolano la fioritura, sono i primi due geni dimostrato di essere impressa nella endosperma e la loro espressione è controllata da metilazione del DNA e demetilazione in piante. Al fine di determinare lo stato imprinting di un gene e pattern di metilazione in endosperma, dobbiamo essere in grado di isolare endosperma prima. Dal seme è piccolo in Arabidopsis, rimane difficile da isolare endosperma Arabidopsis ed esaminare la sua metilazione. In questo protocollo video, si segnala come condurre un incrocio, per isolare il tessuto dell'endosperma da semi, e per determinare lo stato di metilazione mediante sequenziamento bisolfito.
Protocollo
I. genetica Crossing
1. Castrante il genitore femmina
Al fine di distinguere gli alleli materni e paterni, utilizzando sequenza polimorfismo del DNA, due ecotipi diversi, ad esempio, la Columbia-0 (Col-0) e Ler, saranno scelti come genitori femminile e maschile. Le piante devono essere giovani e sani. Si può evirare il genitore femminile utilizzando un microscopio da dissezione, visiera d'ingrandimento, o occhio nudo. Individuare fase-12 fiori (Smyth et al., 1990) e rimuovere eventuali fiori o silique sopra e sotto di loro da taglio alla base del pedicello con le forbici. Sterilizzare pinze immergendo la b....
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Discussione
E 'relativamente facile separare embrione da endosperma e tegumento, ma è noioso per separare endosperma da tegumento, soprattutto per le sementi in fase iniziale o medio-siluro di embriogenesi. Dal cappotto di seme contribuisce solo una piccola quantità di tessuto, per alcuni geni, ad esempio, MEA e FWA, non abbiamo a separare endosperma da tegumento. Questo significa che siamo in grado di isolare RNA da una miscela di endosperma e tessuti tegumento, controllare l'espressione degli alleli mate.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano la signora Jennifer M. Lommel e Tara N. Rognan per la manutenzione degli impianti di Arabidopsis. Questo lavoro è stato sostenuto da fondi di start-up da Saint Louis University e il National Institutes di borse di Salute 1R15GM086846-01 e 3R15GM086846-01S1 a W. Xiao.
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Materiali
Forniture
- Microscopio da dissezione
- Forbici
- Pinza punta fine
- Gioielli Tag
- Impianto Stakes
- Stringa o Twist-Ties
- 4 "X 2" X "in polietilene 8 Borse
- 3 "X 1" X preparati microscopici 1,0 millimetri
- Azoto liquido
- I contenitori di azoto liquido
- Blocco di calore
- Tubi di PCR
- Termociclatore
- Microcentrifuga Tubi
- Microcentrifuga
- Gel elettroforesi impianto
- Arabidopsis thaliana Columbia-0 Piante
- Arabidopsis thaliana Landsberg erecta Piante
Reagenti
- 70% di etanolo
- 95% di etanolo
- 100% di etanolo
- 0,3 M Sorbitolo e 5 mM MES-pH 5,7
- Cetyltrimethyl Bromuro di ammonio (CTAB)
- 100% di etanolo
- Cholorform
- Gli enzimi di restrizione
- 3 M NaOH
- 6,3 M di NaOH
- 6,24 M urea / 4 bisolfito di sodio M
- Distillata sterile H 2 O
- 10 mM Idrochinone
- Wizard DNA Clean-Up System (Promega)
- 10 M NH 4 OAc
- 20 mg / tRNA microlitri
- TE buffer di
- Il TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)
Riferimenti
- Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).
- Cokus, S. J., Feng, S., Zhang, X., Chen, Z., Merriman, B., Haudenschild, C. D., Sriharsa Pradhan, S., Nelson, S. F., Pellegrini, M., Jacobsen, S. E.
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Ristampe e permessi
