Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Recombinante α-β - en γ-Synucleins stimuleren eiwit fosfatase 2A katalytische subeenheid activiteit in cel gratis testen

Published: August 13, 2017 doi: 10.3791/55361
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Sciences, Center of Emphasis in Neurosciences, Graduate School of Biomedical Sciences, Paul L. Foster School of Medicine, Texas Tech University Health Sciences Center El Paso

ERRATUM NOTICE

Summary

Deze publicatie presenteert een protocol waarin wordt beschreven hoe voor het meten van de activiteit van recombinante eiwitten fosfatase 2A katalytische subeenheid (PP2Ac) in reactie op recombinante α-synuclein, β-synuclein, of γ-synuclein eiwitten met behulp van een eenvoudige colorimetrische bepaling. Bevindingen met betrekking tot de specificiteit van de α-synuclein naar PP2Ac laten we zien in de hersenen van de muis.

Abstract

Α-Synuclein (aSyn), β-Synuclein (bSyn) en γ-Synuclein (gSyn) zijn een geconserveerde gezinsleden van de Chaperon-achtige eiwitten die zeer op gewervelde neuronale weefsels worden uitgedrukt. Van de drie synucleins, is alleen aSyn sterk betrokken bij neurodegeneratieve aandoeningen zoals de ziekte van Parkinson, dementie met Lewy organen en voor de verschillende systeem atrofie. Bij het bestuderen van normale aSyn functie, blijkt gegevens dat aSyn stimuleert de activiteit van de katalytische subeenheid van een overvloedig uitgedrukt dephosphorylating enzym, PP2Ac in vitro en in vivo. Voorafgaande gegevens blijkt dat aSyn aggregatie in menselijke hersenen PP2Ac activiteit in regio's met Lewy body pathologie vermindert, waar de oplosbare aSyn onoplosbaar is geworden. Echter, omdat alle drie synucleins aanzienlijke homologie in de sequenties van aminozuur hebben, experimenten werden ontworpen om te testen of alle PP2Ac activiteit kan moduleren. Met behulp van recombinant synucleins en recombinant PP2Ac eiwit, werd activiteit beoordeeld door Malachiet groen colorimetrische bepaling. Gegevens bleek dat alle drie recombinante synucleins PP2Ac activiteit in cel-gratis testen, verhogen van de mogelijkheid dat de geconserveerde homologie tussen synucleins alle drie homologen met de mogelijkheid om te binden begiftigen kan aan en activeer de PP2Ac gestimuleerd. Co-immunoprecipitation gegevens, suggereren echter dat PP2Ac modulatie waarschijnlijk door middel van endogene interacties tussen aSyn en PP2Ac in vivo plaatsvindt.

Introduction

Studies die vaststelling van de verdeling van de synucleins in hersenen en ruggenmerg Toon dat alle drie synucleins zijn verrijkt in zenuwweefsel, hoewel verschillende patronen van lokalisatie geweest gerapporteerd1. Bijvoorbeeld, aSyn is meest overvloedig op presynaptische sites in de hersenschors en basale ganglia2,3, bSyn heeft een meer uniforme verdeling in hersenen en ruggenmerg4,5, en gSyn is meer overvloedig in het ruggenmerg en perifere ganglia6. Hoewel sommige embryonale expressie van alle synucleins optreden kan, worden de drie homologen overvloediger gedurende de neonatale periode4,5,6,7,8. Opmerkelijk, gegevens van synuclein triple knock-out muizen, blijkt dat het verlies van alle drie synucleins veroorzaakt leeftijd begin neuronale dysfunctie9, ondersteunende functies van de belangrijke synuclein in het centrale zenuwstelsel (CNS)10, 11. het is nog niet bekend als de synuclein triple knock-out muizen wijzigingen in PP2Ac distributie of activiteit weergeven. Gegevens uit één synuclein knock-out muizen blijkt dat verlies van aSyn alleen kunnen aanzienlijk verminderen PP2Ac activiteit in de hersenen12is. Naast de CNS lokaliseren alle synucleins aan andere weefsels in het lichaam13,14,15.

Vanwege haar gevestigde genetische linksnaar neurodegeneratie16,17, is aSyn tot de beste studeerde van de drie synucleins. Het laboratorium Perez heeft lang gewerkt om te definiëren van normale functionele activiteiten van aSyn, vooral in de CNS11,12,18,19,20,21, 22,23 en meer recentelijk in perifere weefsels24,25. Daaronder was de ontdekking dat aSyn speelt een belangrijke regelgevende rol in stimulerende PP2Ac activiteit19. PP2A activiteit draagt sterk bij tot normale hersenfunctie, waaronder voor de regulering van dopamine productie26. De holoenzyme van de PP2A bestaat uit drie onafhankelijke subeenheden, de katalytische C subeenheid, PP2Ac, een steiger A-subunit en van verscheidene verschillende regelgevende/targeting B subeenheden die lokaliseren van PP2A aan specifieke subcellular microdomains helpen, waardoor PP2A functionele diversiteit27. Wijst erop dat aSyn interacties met PP2Ac tot haar fosfatase activiteit in vitro en in vivo12,19,21,23bijdragen, 25. Wanneer aSyn hoopt zich op in de eiwit-aggregaten, net zoals wanneer Lewy vorm binnen neuronen van de ziekte van Parkinson en dementie met Lewy organen (DLB) organen, weefsels met geaggregeerde aSyn23,25van de activiteit van de PP2Ac zijn afgenomen, wanneer niveaus van oplosbare aSyn afnemen. Gezien het feit dat alle drie synucleins significante homologie28 hebben (aSyn deelt 66% identiteit met bSyn en 56% met gSyn) en die aSyn draagt bij aan de activering van de PP2Ac, het was veronderstelde dat alle leden van de familie synuclein eiwit mei zitten kundig verhogen PP2Ac activiteit, ten minste in vitro. Om te beoordelen dit, werd PP2Ac activiteit in reactie op de recombinante aSyn, bSyn en gSyn met behulp van een eenvoudige colorimetrische bepaling, gemodelleerd naar de methode van Fathi et al. gemeten 29. deze methode en de nieuwe bevindingen zijn hierin gedetailleerd.

Protocol

1. bereiding van Buffers en reagentia

  1. Voorbereiding van p-nitrofenyl fosfaatbuffer (pNPP)
    1. 50 mL pNPP buffer als volgt voorbereiden.
    2. Weeg 0.30285 g Tris base (Zie de Tabel van materialen) en los het op in 25 mL ultrazuiver gedeïoniseerd water.
      1. Voeg 41.6 µL van 120 mM CaCl2. Aanpassen op pH 7,0 met 1 M HCl en breng het volume van de definitieve oplossing aan met ultrazuiver gedeïoniseerd water 50 mL.
      2. Zorg ervoor dat de uiteindelijke concentratie 50 mM Tris-HCl, 100 mM CaCl2, pH 7.0.
      3. PNPP buffer bij 4 oC. opslaan
  2. Malachiet groen oplossingen, de volgende opstellen.
    1. Oplossing A voorbereiden door 32.8 mL geconcentreerde HCl toe te voegen aan 67.2 mL ultrazuiver gedeïoniseerd water om een 4 M HCl oplossing te maken.
      Opmerking: Malachiet oplossing is bereid in een zuurkast gebruik van wegwerphandschoenen, gezichtsmasker en veiligheidsbril.
    2. Bereiden van oplossing B door weging van 4,2 g ammoniummolybdaat en toe te voegen aan 95,8 mL oplossing A.
    3. Bereid de oplossing C door weging uit 0.045 g Malachiet groen oxalaat zout en het toevoegen van ultrazuiver gedeïoniseerd water om het totale eindvolume tot 100 mL.
    4. Bereid de oplossing D door het mengen van oplossingen B en C bij (v/v)-breedteverhouding van 1:3, roer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
    5. D van de oplossing wordt gefiltreerd door een 0,22 µm porie grootte nitrocellulose membraan filter eenheid met een 50 mL injectiespuit.
    6. Bewaren bereid Malachiet oplossing bij 4 oC beschermd tegen licht.
  3. Voorbereiding van activator
    1. Ter voorbereiding van een 1% Tween-20 oplossing, Pipetteer 10 µL van tween-20 in 990 µL van ultrazuiver gedeïoniseerd water (v/v) en vervolgens tot de tween 20 vortex volledig lost.
  4. Voorbereiding van de werkoplossing voor Malachiet groen tween-20 (MGT).
    1. Meng de activator (stap 1.3) met de Malachiet groen-oplossing (oplossing D, stap 1.2.5) in een verhouding van 1:100 (b.v. 1 µL activator tot 99 µL Malachiet groen oplossing).
  5. Voorbereiding van threonine phosphopeptide (KRpTIRR) (pT) substraat.
    1. Voeg ter voorbereiding van een 2 mM voorraad, plaats een flesje phosphopeptide 1 mg op ijs, 550 µL van ultrazuiver gedeïoniseerd water en vortex zachtjes te ontbinden.
      1. ~ 10 aliquots maken en opslaan van pT bij-20oC.
  6. Synuclein voorbereiding
    1. Synucleins in een zuurkast gebruik van wegwerphandschoenen, gezichtsmasker en veiligheidsbril voor te bereiden.
    2. Resuspendeer 1 mg van recombinante synuclein in 1 mL ultrazuiver gedeïoniseerd water voor een eindconcentratie van 1 mg/mL.
    3. Vortex zachtjes te ontbinden en ijs opleggen.
    4. 50 µL aliquots bereiden en bewaren bij-80 oC.
  7. Opstelling van fosfaat normen
    1. De stockoplossing van 0.1 mM fosfaat als volgt voorbereiden.
      1. Weeg 0.1361 g KH2PO4 en breng in een bekerglas met 80 mL ultrazuiver gedeïoniseerd water. Voeg een roer bar en een mix te ontbinden. Alle van de oplossing overbrengen in een gegradueerde cilinder en brengen het uiteindelijke totale volume met ultrazuiver gedeïoniseerd water tot 100 mL.
      2. Filtreer de volledige oplossing door een 0,22 µm porie grootte nitrocellulose membraan filter eenheid met een 50 mL injectiespuit; de eindconcentratie is 10 mM.
      3. Verdun de 1:100 oplossing (10 mM); de eindconcentratie is 0.1 mM fosfaat (PO4) moet worden gebruikt voor assay normen.
      4. Opslaan van de stockoplossing van fosfaat op 4 oC.
    2. Zie tabel 1 voor het beperken van verdunningen gebruikt om PO4 normen met een totale eindvolume van 1250 µL, elke. Voeg de juiste hoeveelheid fosfaat en ultrapure gedeïoniseerd water 1,5 mL buizen volgens tabel 1.
      1. Winkel bereid PO4 normen bij-20 oC.
Fosfaat normen
0.1 mM PO4 oplossing (mL) 0 75 150 300 600 1.200
Ultrazuiver gedeïoniseerd water (mL) 1.250 1,175 1100 950 650 50
Eindconcentratie van PO4 [pmol] 0 150 300 600 1.200 2400

Tabel 1: Fosfaat normen.

2. PP2A Assay in reactie op de recombinante Synucleins

Opmerking: Het totale eindvolume voor elke reactie wordt 60 µL, zodat de experimentator moet op passende wijze aangepast aan de omvang van de synucleins gebruikt voor elk monster de aanvankelijke omvang van de buffer van de pNPP aanpassen. In de meeste gevallen zullen de omvang van de buffer van de pNPP tussen 40 en 44 µL.

  1. Elke PP2Ac reactie als volgt voorbereiden.
    1. In een buis 1,5 mL, voeg 39 µL van pNPP buffer en plaats op het ijs.
    2. Voeg 1 µL (105 ng/µL of 0.0007 U/µL) van menselijke recombinante PP2Ac (rPP2Ac).
    3. Voeg 4 µL van 0, 1.5, 7.5, 15 of 30 µM synucleins te rPP2Ac in de buffer van de pNPP voor de eindconcentraties van 0, 0.1, 0.5, 1.0 en 2,0 µM en Incubeer bij 4 ° C gedurende 30 minuten op een roterende eenheid; het eindvolume zullen 60 µL.
    4. Na 30 min, verhuizen monsters naar ijs en voeg 16 µL van 2 mM pT substraat.
    5. Incubeer ieder PP2A assay mengsel gedurende 10 minuten staan bij 30 ° C in een waterbad met intermitterende schudden.
    6. Een 96-wells-plaat van platte bodem, toevoegt 25 µL van elk PO4 standaard (0, 150, 300, 600, 1200 en 2400 pmol) in dubbele putten van laag naar hoog.
    7. Vervolgens voegt 25 µL van elk experimentele monster (PP2A assay ± synuclein), bereid in stappen 2.1.1 tot en met 2.1.6, te dupliceren putjes op de dezelfde 96-wells-plaat.
    8. Voeg vervolgens 75 µL van MGT werkoplossing aan elk putje met normen en monsters.
    9. Laat de plaat bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
    10. Observeer een kleur wijzigen in monsters met meetbare verschillen in fosfaat.

3. fotometrische analyse

  1. De 96-wells-plaat met normen en een spectrofotometrische afleesapparaat met de golflengte ingesteld op 630 nm29monsters analyseren.
  2. Uitzetten van de curve van de extinctie geproduceerd (monsters lezen op 630 nm) en merk op dat het lineair tot 2.400 pmol concentratie van PO4blijft.

Representative Results

Eiwitfunctie en activiteit kunnen worden gewijzigd door post-vertalende wijzigingen, zoals fosforylering. Veel eiwitten kunnen worden door een kinase phosphorylated of gedefosforyleerd door een fosfatase. In het geval van eiwit fosfatase 2A (PP2A), deze multisubunit fosfatase vergemakkelijkt de defosforylerings van serine en threonine residuen op een breed aantal phosphoproteins. Abnormale PP2A activiteit kan leiden tot disregulatie van eiwitfunctie die optreedt in vele ziekten, met inbegrip van waar aSyn hyperphosphorylated worden kunnen, de ziekte van Parkinson en de ziekte van Alzheimer waar tau-eiwit hyperphosphorylated kan worden. Dit leverde de rechtvaardiging voor het optimaliseren van een interne procedure om snel PP2Ac activiteit evalueren en bepalen als abnormale PP2Ac activiteit tot cellulaire dysfunction leiden kan.

Met behulp van deze cel-vrije colorimetrische assay, PP2Ac activiteit werd gemeten door het kwantificeren van het bedrag van gratis PO4 gekloofd van de pT substraat (figuur 1A) en vergeleken met bekende picomolar bedragen voor PO4 in de standaard curve (figuur 1B ). PP2Ac activiteit was ook in reactie op 0.0, 0.1, 0.5, 1.0, en 2.0 µM synucleins (figuur 1A), gemeten ten opzichte van de basislijn PP2Ac activiteit in de afwezigheid van toegevoegde synuclein (bij de grote pijl in figuur 1A).

Figure 1
Figuur 1 : PP2A activering door recombinant synucleins, wordt gemeten ten opzichte van bekende niveaus van fosfaat in de normen. In()aSyn, bSyn en gSyn werden geëvalueerd in een bereik van 0 - 2 µM eiwit concentraties, te vergelijken met 0 - 2400 pmol PO4 normen. (B) een standaard curve voor de Malachiet groen PP2Ac assay werd gegenereerd om bekende hoeveelheid fosfaat waartegen in experimentele omstandigheden verkregen waarden kunnen worden berekend. In alle gevallen, wanneer de PP2Ac activiteit toeneemt, de hoeveelheid vrije PO4 gekloofd van de pT-substraat verhoogt en produceert een donkerder groene kleur. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Uit de resultaten blijkt dat toevoeging van synucleins aan PP2Ac in de eerste incubatie stap de hoeveelheid gratis PO4 gemeten, waardoor het aantonen van verhoogde PP2Ac activiteit zou kunnen toenemen. De statistische analyse na vele herhalingen show dat alle drie recombinant synucleins (aSyn, bSyn, gSyn) aanzienlijk PP2Ac activiteit (Figuur 2 verhogen). Deze resultaten suggereren dat wijzigingen in de hoeveelheid oplosbare cellulaire synucleins PP2Ac activiteit veranderen kunnen; en aldus invloed kunnen cellulaire homeostase. Het is niet bekend, echter, als alle drie synucleins aan de activering van het PP2Ac in vivo bijdragen, hoewel de gegevens in Figuur 3 blijkt dat waarschijnlijk aSyn draagt bij aan PP2Ac activiteit in vivo.

Figure 2
Figuur 2 : PP2Ac activiteit wordt gestimuleerd door alle drie synucleins. Grafische weergave van de activering van het PP2Ac in reactie op uiteenlopendeconcentratiesverkrijgbaar van recombinante aSyn, bSyn of gSyn wordt weergegeven. Alle drie recombinante synucleins gestimuleerd PP2Ac activiteit. aSyn in de meeste experimenten bleek iets krachtiger, al ANOVAs uitgevoerd met behulp van statistische software over het algemeen opvallend vergelijkbaar waren. Gegevens vertegenwoordigen de gemiddelde ± SEM van 4-9 onafhankelijke experimenten. ns, niet significant; p < 0,05; p < 0,01; p < 0,0001. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Om te beoordelen welke synuclein(s) interactie met PP2Ac in de hersenen, werden co-immunoprecipitation (Co-IP) tests uitgevoerd met behulp van wild type muis hersenen en het PP2Ac-specifieke-antilichaam, 1 d 6. Eiwitten vervolgens werden gescheiden door SDS-PAGE en vlekken waren gesondeerd voor PP2Ac, aSyn, bSyn en gSyn met behulp van gevestigde methoden19. Recombinant synuclein besturingselementen tonen antilichamenspecificiteit van aSyn, bSyn en gSyn (figuur 3A). Co-IP-gegevens blijkt dat de grote synuclein die zijn gekoppeld aan de PP2Ac in de hersenen aSyn, was zoals veel minder bSyn kwam neer in de co-IP (figuur 3B), en geen gSyn kwam neer in de Co-IP (gegevens niet worden weergegeven). Dit suggereert een onderscheidende rol voor endogene aSyn in de regulatie van PP2Ac in de hersenen. Het werpt ook de mogelijkheid dat modulatie van de PP2Ac met bSyn-gebaseerd-therapieën kon potentieel om te herstellen van PP2A activiteit in die met synucleinopathy, zoals bSyn bekend als nonamyloidogenic nog zoals hier kan stimuleren PP2Ac30, 31.

Figure 3
Figuur 3: Interactie van PP2Ac met endogene synucleins in muis hersenen. (A) Recombinant aSyn, bSyn en gSyn werden gesondeerd met specifieke antilichamen van de synuclein, zoals hieronder beschreven. (B) gebruiken muis hersenen homogenaat Co-IP werd uitgevoerd met antilichaam 1 d 6, dan monsters werden geanalyseerd op immunoblots. Gegevens worden weergegeven voor PP2Ac, aSyn en bSyn, maar niet voor gSyn die deed niet Co-IP met PP2Ac. Start monsters tonen relatieve niveaus van PP2Ac lane (1), aSyn (lane 4), en bSyn (lane 7) in de eerste homogenates. Einde monsters blijkt de resterende niveaus van PP2Ac lane (2), aSyn (lane 5), en bSyn (lane 8) in homogenates na de 1 d-6 PP2Ac Co-IP. Aanzienlijke niveaus van PP2Ac waren immunoprecipitated met behulp van 1 d 6 antilichaam lane (3), waarbij ook afgezet ruime hoeveelheid aSyn (lane 6, op pijl) maar zeer weinig bSyn (lane 9, sterk overbelicht zodat vage bSyn signaal, op pijl). * Sterretjes en haakjes van mark de niet-specifieke signalen op blots. Zie de Tabel van materialen voor meer informatie over antilichamen gebruikt. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

Deze Malachiet groen-assay met pT werd gebruikt voor het meten van PP2Ac activiteit, omdat het eenvoudiger uit te voeren dan de klassieke methode die gebruikmaakt van 32P-gelabelde substraten. Een ander voordeel van deze bepaling over radioactieve testen is dat radio-isotopen sommige risico en kunnen duur, met name 32P-gelabelde moleculen dat korte halfwaardetijd, die beperkt het aantal tests een uitvoeren kunt voordat reagentia verlopen. Met behulp van Malachiet groen in plaats van radioactiviteit elimineert de noodzaak om te beschikken over 32afval P. Malachiet groen tests zijn ook erg gevoelig bij het meten van de activiteit van serine/threonine phosphatases in vergelijking met een andere colorimetrische bepaling die gebruikmaakt van het substraat p-nitrophenylphosphate (pNPP), die is niet-selectieve als het kan worden gedefosforyleerd door een breed aantal enzymen32.

Commerciële Malachiet groen kits voor het meten van de PP2A activiteit hebben al enige tijd beschikbaar en voorheen werden gebruikt in het laboratorium. Bij het doen van veel Malachiet groen testen, werd deze kits echter onbetaalbaar. Bovendien, commerciële kits voor PP2A activiteit zijn stabiel slechts voor één jaar, terwijl de vorm hebben van reagentia beschikbaar in poedervorm en met correcte opslag, over beschikbaar assay-onderdelen die voor langere tijd structureel stabiel zijn.

Voor het testen van bSyn en gSyn, werd aSyn gebruikt als positieve controle ter stimulering van PP2Ac activiteiten en om te bepalen van de hoeveelheid PP2Ac die nodig zijn voor het testen, en ook om te bevestigen dat de resulterende gegevens op de schaal met de standaard curve (150-2400 pmol van PO4 blijven ). Het is opmerkelijk dat als aSyn PP2Ac stimuleert te sterk, al is de reactie meestal lineaire, gegevens zal afgaan op schaal en chemicaliën in de oplossing MGT neerslaan, waardoor het onmogelijk om te meten van de juiste bedragen van vrijgegeven gratis-PO4 met een plaat lezer.

Gezien het feit dat aSyn draagt bij aan PP2Ac activiteit in vivo en in vitro12,19,21,23,25, en dat alle synucleins hebben aanzienlijke homologie, het was geweest veronderstelde dat alle familieleden van de synuclein mei zitten kundig voor stimuleren van PP2Ac in cel gratis testen. Met behulp van de colorimetrische bepaling beschreven hier, bleek het dat inderdaad, alle drie recombinant synucleins (aSyn, bSyn, gSyn) gestimuleerd PP2Ac activiteit, verhogen van de mogelijkheid dat alle drie synucleins soortgelijke functies in het zenuwstelsel vervullen kan. Echter, brain van Parkinson of dementie met Lewy Body gevallen hebben minder PP2Ac activiteit in weefsels met sterk geaggregeerde aSyn23. Muis weefsels herbergen Lewy body-achtige pathologie vertonen ook verminderd PP2Ac activiteit25. Dit, en nieuwe gegevens in Figuur 3 alsmede voorafgaande gegevens van aSyn knock-out muizen12, raden dat noch bSyn, noch gSyn meestal kan compenseren voor het verlies van oplosbare aSyn in de hersenen, of anders dat deze synuclein homologen kunnen niet koppelen met PP2Ac zo sterk als aSyn zoals aangegeven (Figuur 3). De Atlas van de hersenen Allen toont colocalization van alle drie synuclein mRNAs in vele hersengebieden, en hoewel triple synuclein knock-out muizen gegenereerde9,33, PP2Ac activiteit niet is beoordeeld in dat model zijn geweest. Interessant, aSyn die op Ser129 is phosphorylated door Polo-achtig kinase 2, is minder goed in staat om te activeren PP2Ac12, maar bewijs hieronder voor bSyn suggereren dat bSyn fosforylering is onwaarschijnlijk om de impact van de PP2Ac activiteit, zoals zeer weinig bSyn kwam met PP2Ac in de hersenen van de muis (Figuur 3). Samen genomen, blijkt uit de gegevens dat de endogene PP2Ac activiteit modulatoren, zoals aSyn, waarschijnlijk aan wellness- en ziekte bijdragen.

Het protocol hier geschetst is een eenvoudige maar toch krachtige techniek om te bepalen van het vermogen van PP2Ac om de dephosphorylate van een phosphopeptide substraat in reactie op de verschillende behandelingen. Deze zelfde methodologie kan bijvoorbeeld worden gebruikt om te testen van de andere PP2Ac-activators, zoals Ceramiden, alsmede mogelijke nieuwe therapeutics34, of om de impact van PP2Ac remmers in vitro. Het is ook belangrijk erop te wijzen dat soortgelijke testen kunnen het meten van de activiteit van PP2Ac dat heeft op zodanige wijze geïsoleerd door 1 d 6 immunoprecipitation van cel extracten of lichaamsweefsel, zoals hiervoor is beschreven door de auteurs12,19, 25. toekomst toepassingen voor de Malachiet groen assay bestaan buiten het meten van de PP2Ac activiteit, zoals ATP activiteit kan ook worden bepaald met behulp van een dergelijke bepaling.

Opmerking, een standaard curve moet worden gegenereerd elke keer voor elke onafhankelijke PP2Ac assay. Het is verplicht om ervoor te zorgen dat alle gebruikte reagentia fosfaat gratis, zoals gratis fosfaten kunstmatig verhogen van achtergrond signaal en foutieve resultaten opleveren. Op de dag van de test is het essentieel te bereiden genoeg verse MGT oplossing voor alle monsters worden bepaald. Ook is MGT alleen goed de dag dat het is gemaakt en heeft de neiging te precipiteren na een paar uur. PP2Ac gekocht bij een leverancier moet worden aliquotted en opgeslagen bevroren spoedig nadat het is ontvangen ter voorkoming van bevriezing dooi cycli die haar activiteiten te verminderen. Zoals andere phosphatases kunnen de pT substraat (bv PP1 en PP535), dephosphorylate bij het analyseren van extracten van de cel of het weefsel in die PP2Ac heeft niet op zodanige wijze geïsoleerd door immunoprecipitation, monsters via kolommen te verwijderen gratis fosfaten worden doorgegeven en specifieke remmers van phosphatases moeten worden gebruikt ter bevestiging fosfatase specificiteit, als eerder beschreven18.

Disclosures

Dr. Perez was een lid van de faculteit in de afdeling Neurologie aan de Universiteit van Pittsburgh School of Medicine vanaf 1999 – 2011.

Acknowledgments

De auteurs waarderen de inspanningen van de leden van de voorafgaande laboratorium Kendra Mackett, Sandra Slusher en Jie Chen die gewerkt aan het optimaliseren van de methode. De auteurs bedanken ook de National Institutes of Health, Michael J. Fox Foundation, Texas Tech University Health Sciences Center El Paso wetenschappelijke activiteit onderzoek Project (SARP), Lizanell en Colbert Coldwell Foundation, meerdere systeem atrofie coalitie, Hoy familie onderzoek, en Anna Mae Doyle Gift fondsen voor financiële ondersteuning van dit onderzoek.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
1 M Trizma Base Sigma-Aldrich T15003
CaCl2 (calcium chloride) Fisher Scientific C70-500
Concentrated HCl   JT Baker 9535-33
Ammonium molybdate Sigma-Aldrich A1343
Malachite green oxalate salt Sigma-Aldrich M6880
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416
Threonine phosphopeptide (KRpTIRR) New England peptide LLC BP12-011
KH2PO4 (potassium phosphate) Sigma-Aldrich 795488
Recombinant human PP2A C subunit Cayman Chemical  10011237
Recombinant human α-synuclein rPeptide S-1001-2
Recombinant human β-synuclein rPeptide S-1003-2
Recombinant human γ-synuclein rPeptide S-1007-2
PP2Ac 1D6 antibody Millipore 05-421
PP2Ac antibody Novus Biologicals NB100-92217
aSyn antibody C-20 Santa Cruz Biotechnology sc-7011-R
bSyn antibody EP1537Y Novus Biologicals NB100-79903
gSyn antibody E-20 Santa Cruz Biotechnology sc-10698
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL Thermo-Fisher Scientific 89882
Name Company Catalog Number Comments
Equipment/Software
Multiskan Spectrum Plate Reader Thermo Fisher Scientific  51118650
pH Meter  Fisher Scientific  13-636-AB15P

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Li, J., Henning Jensen, P., Dahlstrom, A. Differential localization of alpha-, beta- and gamma-synucleins in the rat CNS. Neurosci. 113 (2), 463-478 (2002).
  2. Iwai, A., et al. The precursor protein of non-A beta component of Alzheimer's disease amyloid is a presynaptic protein of the central nervous system. Neuron. 14 (2), 467-475 (1995).
  3. Irizarry, M. C., et al. Characterization of the precursor protein of the non-A beta component of senile plaques (NACP) in the human central nervous system. J Neuropathol Exp Neurol. 55 (8), 889-895 (1996).
  4. Shibayama-Imazu, T., et al. Cell and tissue distribution and developmental change of neuron specific 14 kDa protein (phosphoneuroprotein 14). Brain Res. 622 (1-2), 17-25 (1993).
  5. Nakajo, S., Shioda, S., Nakai, Y., Nakaya, K. Localization of phosphoneuroprotein 14 (PNP 14) and its mRNA expression in rat brain determined by immunocytochemistry and in situ hybridization. Brain Res Mol Brain Res. 27 (1), 81-86 (1994).
  6. Buchman, V. L., et al. Persyn, a member of the synuclein family, has a distinct pattern of expression in the developing nervous system. J Neurosci. 18 (22), 9335-9341 (1998).
  7. George, J. M., Jin, H., Woods, W. S., Clayton, D. F. Characterization of a novel protein regulated during the critical period for song learning in the zebra finch. Neuron. 15 (2), 361-372 (1995).
  8. Withers, G. S., George, J. M., Banker, G. A., Clayton, D. F. Delayed localization of synelfin (synuclein, NACP) to presynaptic terminals in cultured rat hippocampal neurons. Brain Res Dev Brain Res. 99 (1), 87-94 (1997).
  9. Greten-Harrison, B., et al. alphabetagamma-Synuclein triple knockout mice reveal age-dependent neuronal dysfunction. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19573-19578 (2010).
  10. Benskey, M. J., Perez, R. G., Manfredsson, F. P. The contribution of alpha synuclein to neuronal survival and function - Implications for Parkinson's Disease. J Neurochem. , (2016).
  11. Perez, R. G., Hastings, T. G. Could a loss of alpha-synuclein function put dopaminergic neurons at risk? J Neurochem. 89 (6), 1318-1324 (2004).
  12. Lou, H., et al. Serine 129 phosphorylation reduces the ability of alpha-synuclein to regulate tyrosine hydroxylase and protein phosphatase 2A in vitro and in vivo. J Biol Chem. 285 (23), 17648-17661 (2010).
  13. Akil, O., et al. Localization of Synucleins in the Mammalian Cochlea. JARO. 9 (4), 452-463 (2008).
  14. Guardia-Laguarta, C., et al. alpha-Synuclein Is Localized to Mitochondria-Associated ER Membranes. J Neurosci. 34 (1), 249-259 (2014).
  15. Shibayama-Imazu, T., et al. Distribution of PNP 14 (beta-synuclein) in neuroendocrine tissues: localization in Sertoli cells. Mol Reprod Dev. 50 (2), 163-169 (1998).
  16. Goedert, M. Alpha-synuclein and neurodegenerative diseases. Nat Rev Neurosci. 2 (7), 492-501 (2001).
  17. Goedert, M., Spillantini, M. G., Del Tredici, K., Braak, H. 100 years of Lewy pathology. Nat Rev Neurol. 9 (1), 13-24 (2013).
  18. Alerte, T. N., et al. Alpha-synuclein aggregation alters tyrosine hydroxylase phosphorylation and immunoreactivity: lessons from viral transduction of knockout mice. Neurosci Lett. 435 (1), 24-29 (2008).
  19. Peng, X., Tehranian, R., Dietrich, P., Stefanis, L., Perez, R. G. Alpha-synuclein activation of protein phosphatase 2A reduces tyrosine hydroxylase phosphorylation in dopaminergic cells. J Cell Sci. 118 (Pt 15), 3523-3530 (2005).
  20. Perez, R. G., et al. A role for alpha-synuclein in the regulation of dopamine biosynthesis. J Neurosci. 22 (8), 3090-3099 (2002).
  21. Porras, J. L., Perez, R. G. Ch. III. Nova Publishers - Alpha-Synuclein. Kanowitz, H. C., Polizzi, M. , NOVA Science Publishers. 51-70 (2014).
  22. Tehranian, R., Montoya, S. E., Van Laar, A. D., Hastings, T. G., Perez, R. G. Alpha-synuclein inhibits aromatic amino acid decarboxylase activity in dopaminergic cells. J Neurochem. 99 (4), 1188-1196 (2006).
  23. Wu, J., et al. Lewy-like aggregation of alpha-synuclein reduces protein phosphatase 2A activity in vitro and in vivo. Neuroscience. 207, 288-297 (2012).
  24. Geng, X., et al. alpha-Synuclein binds the K(ATP) channel at insulin-secretory granules and inhibits insulin secretion. Am J Physiol Endocrinol Metab. 300 (2), E276-E286 (2011).
  25. Farrell, K. F., et al. Non-motor parkinsonian pathology in aging A53T alpha-synuclein mice is associated with progressive synucleinopathy and altered enzymatic function. J Neurochem. 128 (4), 536-546 (2014).
  26. Janssens, V., Goris, J. Protein phosphatase 2A: a highly regulated family of serine/threonine phosphatases implicated in cell growth and signalling. Biochem J. 353 (Pt 3), 417-439 (2001).
  27. Wlodarchak, N., Xing, Y. PP2A as a master regulator of the cell cycle. Critical reviews in biochemistry and molecular biology. 51 (3), 162-184 (2016).
  28. George, J. M. The synucleins. Genome Biol. 3 (1), (2002).
  29. Fathi, A. R., Krautheim, A., Lucke, S., Becker, K., Juergen Steinfelder, H. Nonradioactive technique to measure protein phosphatase 2A-like activity and its inhibition by drugs in cell extracts. Anal Biochem. 310 (2), 208-214 (2002).
  30. Hashimoto, M., et al. An antiaggregation gene therapy strategy for Lewy body disease utilizing beta-synuclein lentivirus in a transgenic model. Gene Ther. 11 (23), 1713-1723 (2004).
  31. Hashimoto, M., Rockenstein, E., Mante, M., Mallory, M., Masliah, E. beta-Synuclein inhibits alpha-synuclein aggregation: a possible role as an anti-parkinsonian factor. Neuron. 32 (2), 213-223 (2001).
  32. McAvoy, T., Nairn, A. C. Serine/threonine protein phosphatase assays. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 18, (2010).
  33. Anwar, S., et al. Functional alterations to the nigrostriatal system in mice lacking all three members of the synuclein family. J Neurosci. 31 (20), 7264-7274 (2011).
  34. Vargas-Medrano, J., et al. Novel FTY720-based compounds stimulate neurotrophin expression and phosphatase activity in dopaminergic cells. ACS Med Chem Lett. 5 (7), 782-786 (2014).
  35. Moorhead, G. Chapter 3, Small-molecule inhibitors of Ser/Thr protein phosphatases. Methods in Molecular Biology. 365, Protein Phosphatase Protocols, Humana Press. Totowa, New Jersey. 23-38 (2007).

Tags

Neurowetenschappen kwestie 126 colorimetrische bepaling defosforylerings malachiet fosfaat fosfatase activiteit PP2A katalytische subeenheid recombinante eiwitten synucleins threonine phosphopeptide

Erratum

Formal Correction: Erratum: Recombinant α- β- and γ-Synucleins Stimulate Protein Phosphatase 2A Catalytic Subunit Activity in Cell Free Assays
Posted by JoVE Editors on 04/01/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Recombinant α- β- and γ-Synucleins Stimulate Protein Phosphatase 2A Catalytic Subunit Activity in Cell Free Assays

One of the authors' names was corrected from:

Brian Marcus

to:

Brian S. Marcus

Recombinante α-β - en γ-Synucleins stimuleren eiwit fosfatase 2A katalytische subeenheid activiteit in cel gratis testen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lek, S., Vargas-Medrano, J.,… More

Lek, S., Vargas-Medrano, J., Villanueva, E., Marcus, B. S., Godfrey, W., Perez, R. G. Recombinant α- β- and γ-Synucleins Stimulate Protein Phosphatase 2A Catalytic Subunit Activity in Cell Free Assays. J. Vis. Exp. (126), e55361, doi:10.3791/55361 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter