Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Рекомбинантных α-β - и γ-Synucleins стимулировать активность белка фосфатазы 2A каталитическая субъединица в ячейке бесплатные анализы

Published: August 13, 2017 doi: 10.3791/55361
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Sciences, Center of Emphasis in Neurosciences, Graduate School of Biomedical Sciences, Paul L. Foster School of Medicine, Texas Tech University Health Sciences Center El Paso

ERRATUM NOTICE

Summary

Эта публикация представляет протокол показаны как измерить активность рекомбинантных белков фосфатазы 2A каталитическая субъединица (PP2Ac) в ответ на рекомбинантных α-synuclein, β-synuclein или γ-synuclein белков с помощью простой колориметрического анализа. Мы показываем заключений α-synuclein специфичность к PP2Ac в мозг мыши.

Abstract

Α-Synuclein (aSyn), β-Synuclein (bSyn) и γ-Synuclein (gSyn) являются членами сохраняется семьи шаперонов подобных белков, которые сильно выражены в позвоночных нейронной ткани. Из трех synucleins только aSyn был сильно вовлечен в нейродегенеративных расстройств, таких как болезнь Паркинсона, слабоумие с органами Леви и несколько системы атрофии. В изучении нормальной aSyn функции, данные указывают, что aSyn стимулирует активность каталитическая субъединица обильно выраженной dephosphorylating фермента, PP2Ac в пробирке и в естественных условиях. Предыдущие данные показывают, что aSyn агрегата в мозге человека уменьшает PP2Ac активность в регионах с патологией органа Леви, где растворимых aSyn стала неразрешимой. Однако потому что все три synucleins имеют значительные гомологии аминокислотных последовательностей, эксперименты были разработаны для проверки, если все можно модулировать активность PP2Ac. С помощью рекомбинантной synucleins и Рекомбинантный белок PP2Ac, активность оценивали Малахитовый зеленый колориметрического анализа. Данные показали, что все три рекомбинантных synucleins стимулировали деятельность PP2Ac в свободной ячейке анализов, повышение возможности, что сохраняется гомологии между synucleins могут наделить способностью связывать и активировать PP2Ac все три гомолог. Co Иммунопреципитация данных, однако, предположить, что PP2Ac модуляции вероятно происходит через эндогенные взаимодействия между aSyn и PP2Ac в естественных условиях.

Introduction

Определение распределения synucleins в мозг и спинной мозг шоу, что все три synucleins обогащаются в нервных тканях, хотя разные модели локализации были исследования сообщили1. К примеру aSyn наиболее распространенных на пресинаптическом участках в коре и базальных ганглиев2,3, bSyn имеет более равномерное распределение в мозг и спинной мозг4,5, и gSyn более обильны в спинной и периферических ганглиях6. Хотя могут возникнуть некоторые эмбриональных выражение всех synucleins, три гомолог становятся более обильны в неонатальный период4,5,6,,78. Удивительно данные от synuclein Двухместный нокаут мышей, указывают, что потеря всех трех synucleins вызывает возраст наступления нейрональных дисфункции9, поддержка функций важных synuclein в центральной нервной системы (ЦНС)10, 11. он пока еще не известно, если synuclein Двухместный нокаут мышей показывают изменения в PP2Ac распределения или деятельности. Данные из одного synuclein нокаут мышей показывают, что потеря aSyn только способна значительно уменьшить PP2Ac активность в мозге12. В дополнение к ЦНС все synucleins локализовать в другие ткани во всем теле13,14,15.

Из-за ее устоявшихся генетические связи нейродегенеративные16,17aSyn среди лучших изучается из трех synucleins. Лаборатория Перес долгое время работал для определения нормальной функциональной деятельности aSyn, особенно в ЦНС11,12,18,19,,20,21 22,23 и совсем недавно в периферических тканях24,25. Среди них было открытие, что aSyn играет ключевую роль регулирования в стимулировании деятельности PP2Ac19. PP2A деятельность способствует широко нормального мозга функции, в том числе для регулирования допамина производства26. PP2A Холофермент состоит из трех независимых подразделений, каталитическая субъединица C, PP2Ac, леса A подгруппы и один из нескольких различных нормативных/ориентация B подразделения, которые помогают локализовать PP2A к конкретным внутриклеточных microdomains, обеспечивая PP2A 27функциональное разнообразие. Данные показывают, что aSyn взаимодействия с PP2Ac в значительной степени способствовать ее фосфатазы активность in vitro и in vivo12,19,21,23, 25. Когда aSyn накапливается в агрегатах белка, как он делает, когда Леви органов формы внутри нейронов болезнь Паркинсона и деменция с органами Леви (ДЛБ), тканей с агрегированных aSyn уменьшились PP2Ac деятельность23,25, когда уровень растворимых aSyn уменьшить. Учитывая, что все три synucleins имеют значительную гомологию28 (aSyn разделяет 66% личность с bSyn и 56% с gSyn) и что aSyn способствует активации PP2Ac, он предположил, что все члены семьи synuclein белка может быть в состоянии повышение активности PP2Ac, по крайней мере в пробирке. Чтобы оценить это, измеряли активность PP2Ac в ответ на рекомбинатных aSyn, bSyn и gSyn, с помощью простой колориметрического анализа, моделируется после метода Фатхи et al. 29. Этот метод и Роман выводы подробно здесь.

Protocol

1. Подготовка буферов и реагенты

  1. Подготовка буфера p нитрофенил фосфат (pNPP)
    1. 50 мл буфера pNPP готовят следующим образом.
    2. Вес 0.30285 g Tris база (см. Таблицу материалы) и растворяют в 25 мл сверхчистого деионизованной воды.
      1. 41.6 мкл CaCl 120 мм2. Приспособиться к рН 7.0 с 1 M HCl и доводят объем окончательного решения до 50 мл сверхчистого деионизированной водой.
      2. Убедитесь, что конечная концентрация 50 мм трис-HCl, 100 мм2CaCl, pH 7.0.
      3. Хранить pNPP буфер в 4 oC.
  2. Малахитовый зеленый решений подготовьте следующее.
    1. Подготовьте раствор А , добавив 32.8 мл концентрированной HCl 67,2 мл сверхчистого обессоленной воды для создания решения 4 М HCl.
      Примечание: Раствор Малахитовом готовится в вытяжного шкафа, используя одноразовые перчатки, -маски и защитные очки.
    2. Готовят раствор Б весом, 4.2 g Молибдат аммония и добавив его на 95,8 мл раствора а.
    3. Готовят раствор C весом не 0,045 г Малахитовый зеленый оксалата соли и добавляя сверхчистого деионизированной воды довести окончательный общий объем до 100 мл.
    4. Готовят раствор D путем смешивания решения B и C в соотношении 1:3 (v/v), движение за 1 ч при комнатной температуре.
    5. D решение фильтра через 0,22 мкм поры размер нитроцеллюлозные мембранные фильтр с помощью шприца 50 мл.
    6. Храните подготовленных Малахит решение на 4 oC, защищенном от света.
  3. Подготовка активатор
    1. Подготовить 1% анимации 20 решения, пипетки 10 мкл анимации 20 в 990 мкл сверхчистого деионизированной воды (v/v) то водоворот до анимации 20 растворяется полностью.
  4. Приготовление рабочего раствора Малахитовый зеленый анимации 20 (MGT).
    1. Активатор (шаг 1.3) смешайте с Малахитовый зеленый решение (решения D, шаг 1.2.5) в соотношении 1: 100 (например 1 мкл активатор Малахитовый зеленый решение 99 мкл).
  5. Подготовка треонин phosphopeptide (KRpTIRR) (pT) субстрата.
    1. Подготовить инвентарь, место 2 мм 1 мг флакон phosphopeptide на льду, 550 мкл сверхчистого деионизированной воды и вихревой мягко распустить.
      1. ~ 10 аликвоты и сохранить pT в-20oC.
  6. Подготовка Synuclein
    1. Подготовка synucleins в вытяжного шкафа, используя одноразовые перчатки, -маски и защитные очки.
    2. Ресуспензируйте 1 мг рекомбинантного synuclein в 1 мл сверхчистого деионизированную воду для конечной концентрации 1 мг/мл.
    3. Вихрь осторожно, чтобы растворить и место на льду.
    4. Подготовка 50 мкл аликвоты и хранить в-80 oC.
  7. Подготовка стандартов фосфат
    1. Стоковый раствор 0,1 мм фосфат готовят следующим образом.
      1. Весят 0.1361 g KH2PO4 и место в стакан с 80 мл сверхчистого деионизованной воды. Добавьте движение бар и микс растворить. Все решения передать мерного цилиндра и принести окончательный объем 100 мл сверхчистого деионизированной водой.
      2. Фильтрация всего решения через 0,22 мкм поры размер нитроцеллюлозные мембранные фильтр с помощью шприца 50 мл; конечная концентрация составляет 10 мм.
      3. Разбавить раствор (10 мм) 1: 100; конечная концентрация будет 0.1 мм фосфат (PO4) использоваться для анализа стандартов.
      4. Хранят раствор фосфатов на 4 oC.
    2. Приведена таблица 1 ограничение разведения, используемый для сделать PO4 стандартов с Заключительный общий объем 1250 мкл. Добавьте соответствующее количество фосфатов и особочистых обессоленной воды для 1.5 мл пробирок согласно таблице 1.
      1. Магазин, подготовленный PO4 стандартов на-20 oC.
Фосфат стандарты
0,1 мм PO4 решение (мл) 0 75 150 300 600 1200
Сверхчистый деонизированной воды (мл) 1250 1175 1100 950 650 50
Конечная концентрация PO4 [пмоль] 0 150 300 600 1200 2400

Таблица 1: Фосфат стандарты.

2. PP2A Assay в ответ на рекомбинатных Synucleins

Примечание: Окончательный объем для каждой реакции будет 60 мкл, поэтому экспериментатор должен настроить начальный объем буфера pNPP надлежащим образом для размещения тома synucleins, используемый для каждого образца. В большинстве случаев объем буфера pNPP будет между 40 и 44 мкл.

  1. Каждый PP2Ac реакции готовят следующим образом.
    1. В 1,5 мл трубку мкл 39 pNPP буфер и место на льду.
    2. Добавить 1 мкл (105 нг/мкл или 0.0007 U/мкл) человеческого рекомбинантного PP2Ac (rPP2Ac).
    3. Добавьте 4 мкл 0, 1,5, 7,5, 15 или 30 мкм synucleins к rPP2Ac в pNPP буфер для окончательного концентрации 0, 0.1, 0.5, 1.0 и 2.0 мкм и Инкубируйте на 4 ° C на 30 мин на блоком вращающихся; Окончательный объем будет 60 мкл.
    4. После 30 мин переместите образцы льда и 16 мкл субстрата pT 2 мм.
    5. Инкубируйте каждой смеси assay PP2A 10 мин при 30 ° C на водяной бане с периодически встряхивая.
    6. Плоское дно 96-луночных тарелку, добавить 25 мкл каждого PO4 стандартных (0, 150, 300, 600, 1200 и 2400 пмоль) в повторяющихся скважин от низкого до высокого.
    7. Следующая 25 мкл каждого экспериментального образца (PP2A пробирного ± synuclein), подготовленный в шаги 2.1.1 для 2.1.6, чтобы дублировать скважин на пластину же 96-луночных.
    8. Далее добавьте 75 мкл рабочего раствора MGT каждый хорошо содержит стандарты и образцы.
    9. Пластины оставьте при комнатной температуре в течение 10 мин.
    10. Наблюдать за цвет изменить в образцах, имеющих поддающиеся измерению различиях в уровнях фосфата.

3. фотометрические анализ

  1. Анализируйте 96-луночных пластины, содержащие стандарты и образцы, используя читателя спектрофотометрические пластины с волны, набор до 630 Нм29.
  2. Участок кривой поглощения производятся (образцы читать в 630 Нм) и обратите внимание, что он остается линейным до 2400 пмоль концентрация PO4.

Representative Results

Белка функции и деятельность может быть изменено, столб-поступательные изменения, например фосфорилирования. Многие белки может быть фосфорилированных киназы, или dephosphorylated, фосфатазы. В случае белка фосфатазы 2A (PP2A), это multisubunit фосфатазы облегчает дефосфорилирование серина и треонина остатков на широкий ряд фосфолипопротеиновый. Аномальные PP2A активность может привести к регуляции функции белка, которая происходит во многих заболеваний, в том числе где aSyn может стать hyperphosphorylated, болезнь Паркинсона и болезнь Альцгеймера, где тау-белка может стать hyperphosphorylated. Это дало основания для оптимизации внутренней процедуры быстро оценить активность PP2Ac и определить, если аномальной активности PP2Ac может привести к сотовой дисфункции.

Используя этот сотовый бесплатно колориметрические assay, PP2Ac, путем определения количественных показателей количество свободного PO4 измеряли активность расщепляется от субстрата pT (рис. 1A) и по сравнению с известным picomolar количество PO4 в стандартной кривой (Рисунок 1B ). Деятельность PP2Ac была также измеряется в ответ на 0.0, 0.1, 0.5, 1.0 и 2.0 мкм synucleins (рис. 1а), по сравнению с базовой PP2Ac активности в отсутствие добавлен synuclein (на больших стрелка на рисунке 1A).

Figure 1
Рисунок 1 : PP2A активации рекомбинантных synucleins, измеряется по отношению к известным уровень фосфата в стандартах. В (A) aSyn, bSyn и gSyn были оценены в диапазоне от 0 - 2 мкм концентрацию белка, сравниваемый с 0 - 2400 пмоль PO4 стандартов. Калибровочной кривой (B) для assay Малахитовый зеленый PP2Ac был создан для предоставления известных количество фосфатов, против которого могут быть рассчитаны значения, полученные в экспериментальных условиях. Во всех случаях когда PP2Ac активность возрастает, количество свободного PO4 расщепляется от субстрата pT увеличивается и производит темнее зеленого цвета. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Результаты показывают, что добавление synucleins в PP2Ac на этапе первоначального инкубации может увеличить количество PO бесплатно4 измеряется, продемонстрировав тем самым повышение активности PP2Ac. Статистический анализ после того, как много повторов показывают, что все три рекомбинантных synucleins (aSyn, bSyn, gSyn) значительно увеличить PP2Ac активности (рис. 2). Эти результаты позволяют предположить, что изменения количества растворимых сотовой synucleins может изменить PP2Ac деятельности; и таким образом могут повлиять клеточного гомеостаза. Это не известно, однако, если все три synucleins способствуют активации PP2Ac в естественных условиях, хотя данные на рисунке 3 позволяют предположить, что aSyn вероятно, способствует PP2Ac активности в естественных условиях.

Figure 2
Рисунок 2 : PP2Ac деятельность стимулируется всеми тремя synucleins. Показано графическое представление PP2Ac активации в ответ на различной концентрации рекомбинантных aSyn, bSyn или gSyn. Все три рекомбинантных synucleins стимулировало активность PP2Ac. aSyn в большинстве экспериментов, как представляется, быть немного более мощным, хотя ANOVAs с использованием статистического программного обеспечения в целом были удивительно похожи. Данные представляют собой среднее ± SEM 4-9 независимых экспериментов. ns, не значительными; p < 0,05; p < 0,01; p < 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Чтобы оценить, какие synuclein(s) может взаимодействовать с PP2Ac в мозге, co иммунопреципитация (Co-IP) анализы были проведены с использованием дикого типа мыши мозга и PP2Ac-специфические антитела, 1 d 6. Белки, затем были отделены от SDS-PAGE и помарки были зондируемой для PP2Ac, aSyn, bSyn и gSyn, с использованием установленных методов19. Контроль рекомбинантный synuclein продемонстрировать Специфичность антител aSyn, bSyn и gSyn (рис. 3A). Co-IP-данные показывают, что крупные synuclein, связанные с PP2Ac в мозге была aSyn, гораздо менее bSyn сошел в co-IP (рисунок 3B), а не gSyn сошел в Co-IP (данные не показаны). Это предполагает видную роль для эндогенного aSyn в регуляции PP2Ac в мозге. Это также повышает возможность, что PP2Ac модуляции с bSyn-на основе терапии может иметь потенциал для восстановления PP2A активности в тех, с synucleinopathy, как bSyn, как известно, nonamyloidogenic еще, как показано здесь, можно стимулировать PP2Ac30, 31.

Figure 3
Рисунок 3: Взаимодействие PP2Ac с эндогенного synucleins в мозг мыши. (A) рекомбинантный aSyn, bSyn и gSyn были зондируемой с synuclein специфических антител, как описано ниже. (B) использование мыши мозга огневки, выполненных с антителом 1 d 6, Co-IP, затем образцы были проанализированы на иммуноблотов. Данные приведены для PP2Ac, aSyn и bSyn, но не для gSyn, который сделал не Co-IP с PP2Ac. Запуск образцов показывают относительные уровни PP2Ac (полоса 1), aSyn (пер. 4) и bSyn (переулок 7) в первоначальной гомогенатах. Конец образцы Показать оставшиеся уровни PP2Ac (пер. 2), aSyn (майной 5) и bSyn (лэйн 8) в гомогенатах после 1 d 6 PP2Ac Co-IP. Значительный уровень PP2Ac были immunoprecipitated с помощью 1 d 6 антитела (пер. 3), который также сбит достаточное количество aSyn (переулок 6, на стрелку), но очень мало bSyn (Лейн 9, сильно переэкспонированных Показать bSyn слабый сигнал, на стрелку). * Звездочки и кронштейны Марк неконкретные сигналы на помарки. Смотреть Таблицу материалов для деталей на антитела, которые используются. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

Этот assay Малахитовый зеленый с pT был использован для измерения активности PP2Ac, потому что это легче выполнить, чем классический метод, который использует 32P, меченного субстратов. Еще одно преимущество этой пробирного над радиоактивными анализов — что радиоизотопов представляют определенный риск и может быть дорогостоящим, особенно 32P, меченного молекулы, имеют короткий период полураспада, который ограничивает количество анализов, которые одно может выполнять до истечения реагентами. С помощью Малахитовый зеленый вместо радиоактивности также устраняет необходимость распоряжаться 32P отходов. Малахитовый зеленый анализов также весьма чувствительны при измерении активность фосфатаз Серин/треонин по сравнению с другой колориметрические assay который использует субстрата-p-nitrophenylphosphate (pNPP), который является неселективной, как это может быть dephosphorylated широкого ряда ферментов32.

Коммерческие Малахитовый зеленый комплекты для измерения активности PP2A были доступны в течение некоторого времени и ранее были использованы в лаборатории. Однако при выполнении многих Малахитовый зеленый анализов, такие комплекты стал слишком дорого. Кроме того коммерческие наборы для PP2A деятельности стабильны только за один год, в то время как имея реагентов в сухой форме и с надлежащего хранения, обеспечивают легко доступны пробирного компоненты, которые структурно стабильны для длительных периодов времени.

Перед тестированием, bSyn и gSyn, aSyn был использован в качестве позитивного элемента управления для стимулирования деятельности PP2Ac и определить количество PP2Ac, необходимых для анализов, а также подтвердить, что полученные данные остаются на шкале с калибровочной кривой (150-2400 пмоль PO4 ). Примечательно, что если aSyn стимулирует PP2Ac слишком сильно, хотя реакция обычно линейной, данных будет сходить масштаба и химических веществ в растворе MGT осадок, что делает невозможным для определения точной суммы выпущен бесплатно PO4 с тарелкой читатель.

Учитывая, что aSyn способствует PP2Ac активности в естественных условиях и в пробирке12,19,21,23,25, и что все synucleins имеют значительную гомологию, он был предположил, что все члены семьи synuclein могут быть способны стимулировать PP2Ac в ячейке бесплатные анализы. С помощью колориметрических assay описано здесь, было установлено, что действительно, все три рекомбинантных synucleins (aSyn, bSyn, gSyn) стимулируют PP2Ac активности, повышение возможности, что все три synucleins могут выполнять аналогичные функции в нервной системе. Однако, мозг от Паркинсона или слабоумия с телом Lewy дела имеют меньше PP2Ac активности в тканях, содержащих весьма агрегированных aSyn23. Мыши тканей, укрывательство Леви, тело как патологии также демонстрируют снижение PP2Ac активности25. Это, и новые данные на рисунке 3 , а также предыдущие данные от aSyn нокаут мышей12, настоятельно рекомендуем, что ни bSyn, ни gSyn не могут обычно компенсировать потери растворимых aSyn в мозг или, альтернативно, что те synuclein гомолог может не Свяжите с PP2Ac как сильно как aSyn как показано на рисунке (рис. 3). Атлас мозга Аллен показывает colocalization всех трех synuclein mRNAs во многих областях мозга, и хотя тройной synuclein нокаут мышей были созданные9,33, PP2Ac активность не были оценены в этой модели. Интересно, что aSyn, что фосфорилированных на Ser129 по поло как киназа 2, в меньшей степени способны активировать PP2Ac12, но доказательств, показанный здесь, для bSyn предлагаю что фосфорилирование bSyn вряд ли воздействие PP2Ac деятельности, как очень мало bSyn сошел с PP2Ac в мозг мыши (рис. 3). Взятые вместе, данные показывают, что эндогенного модуляторов активности PP2Ac, как aSyn, скорее всего, способствовать оздоровительный и болезней.

Протокол, изложенные здесь является простой, но мощный метод для определения способности PP2Ac для dephosphorylate phosphopeptide субстрата в ответ на различные косметические процедуры. Например эта же методология может использоваться для тестирования других PP2Ac активаторы, церамиды, а также потенциальных Роман терапии34, или для оценки влияния PP2Ac ингибиторов в пробирке. Важно также отметить, что подобные анализы можно измерить активность PP2Ac, который изолировал 1 d 6 иммунопреципитации от выдержек клетки или ткани организма, как описано ранее, авторы12,19, 25. будущее приложений для assay Малахитовый зеленый существуют вне определения PP2Ac активности, как активность АТФ может также определяться с помощью такого анализа.

Обратите внимание, что калибровочной кривой должны создаваться каждый раз для каждого независимого PP2Ac assay. Он является обязательным для обеспечения все реагенты используемые фосфат бесплатно, как свободный фосфаты искусственно увеличить фонового сигнала и ошибочных результатов. В день анализа важно подготовить достаточно свежий раствор MGT для всех образцов быть assayed. Кроме того MGT хороша только в день, что он производится и клонит осадить через несколько часов. PP2Ac, приобретенных у поставщика должен быть aliquotted и хранить замороженные вскоре после его получения для предотвращения циклов оттаивания замораживание, которые снижают свою активность. Как другие фосфатаз может dephosphorylate pT субстрата (например PP1 и PP535), при анализе экстрактов клетки или ткани, в которых PP2Ac не были изолированы по иммунопреципитации, образцы должны передаваться через столбцы для удаления бесплатно фосфаты и специфичные ингибиторы фосфатаз должны быть использованы для подтверждения фосфатазы специфики, как описано18.

Disclosures

Д-р Перес был членом факультета кафедры неврологии в университете Питтсбурга школы медицины с 1999 – 2011.

Acknowledgments

Авторы признательны за усилия членов предварительного лабораторного Кендра Mackett, Сандра Slusher и Чэнь Jie, который работал для оптимизации метода. Авторы также признательны национальных институтов здравоохранения, Майкл Джей Фокс фонда, Техас Tech университета здравоохранения наук Центр Эль-Пасо научной деятельности исследований проекта (САРП), Lizanell и Кольбер Coldwell фонд, множественные системы атрофия коалиции, Hoy семьи исследования и Анна Мэй Дойл подарок средств для финансовой поддержки этого исследования.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
1 M Trizma Base Sigma-Aldrich T15003
CaCl2 (calcium chloride) Fisher Scientific C70-500
Concentrated HCl   JT Baker 9535-33
Ammonium molybdate Sigma-Aldrich A1343
Malachite green oxalate salt Sigma-Aldrich M6880
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416
Threonine phosphopeptide (KRpTIRR) New England peptide LLC BP12-011
KH2PO4 (potassium phosphate) Sigma-Aldrich 795488
Recombinant human PP2A C subunit Cayman Chemical  10011237
Recombinant human α-synuclein rPeptide S-1001-2
Recombinant human β-synuclein rPeptide S-1003-2
Recombinant human γ-synuclein rPeptide S-1007-2
PP2Ac 1D6 antibody Millipore 05-421
PP2Ac antibody Novus Biologicals NB100-92217
aSyn antibody C-20 Santa Cruz Biotechnology sc-7011-R
bSyn antibody EP1537Y Novus Biologicals NB100-79903
gSyn antibody E-20 Santa Cruz Biotechnology sc-10698
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL Thermo-Fisher Scientific 89882
Name Company Catalog Number Comments
Equipment/Software
Multiskan Spectrum Plate Reader Thermo Fisher Scientific  51118650
pH Meter  Fisher Scientific  13-636-AB15P

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Li, J., Henning Jensen, P., Dahlstrom, A. Differential localization of alpha-, beta- and gamma-synucleins in the rat CNS. Neurosci. 113 (2), 463-478 (2002).
  2. Iwai, A., et al. The precursor protein of non-A beta component of Alzheimer's disease amyloid is a presynaptic protein of the central nervous system. Neuron. 14 (2), 467-475 (1995).
  3. Irizarry, M. C., et al. Characterization of the precursor protein of the non-A beta component of senile plaques (NACP) in the human central nervous system. J Neuropathol Exp Neurol. 55 (8), 889-895 (1996).
  4. Shibayama-Imazu, T., et al. Cell and tissue distribution and developmental change of neuron specific 14 kDa protein (phosphoneuroprotein 14). Brain Res. 622 (1-2), 17-25 (1993).
  5. Nakajo, S., Shioda, S., Nakai, Y., Nakaya, K. Localization of phosphoneuroprotein 14 (PNP 14) and its mRNA expression in rat brain determined by immunocytochemistry and in situ hybridization. Brain Res Mol Brain Res. 27 (1), 81-86 (1994).
  6. Buchman, V. L., et al. Persyn, a member of the synuclein family, has a distinct pattern of expression in the developing nervous system. J Neurosci. 18 (22), 9335-9341 (1998).
  7. George, J. M., Jin, H., Woods, W. S., Clayton, D. F. Characterization of a novel protein regulated during the critical period for song learning in the zebra finch. Neuron. 15 (2), 361-372 (1995).
  8. Withers, G. S., George, J. M., Banker, G. A., Clayton, D. F. Delayed localization of synelfin (synuclein, NACP) to presynaptic terminals in cultured rat hippocampal neurons. Brain Res Dev Brain Res. 99 (1), 87-94 (1997).
  9. Greten-Harrison, B., et al. alphabetagamma-Synuclein triple knockout mice reveal age-dependent neuronal dysfunction. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19573-19578 (2010).
  10. Benskey, M. J., Perez, R. G., Manfredsson, F. P. The contribution of alpha synuclein to neuronal survival and function - Implications for Parkinson's Disease. J Neurochem. , (2016).
  11. Perez, R. G., Hastings, T. G. Could a loss of alpha-synuclein function put dopaminergic neurons at risk? J Neurochem. 89 (6), 1318-1324 (2004).
  12. Lou, H., et al. Serine 129 phosphorylation reduces the ability of alpha-synuclein to regulate tyrosine hydroxylase and protein phosphatase 2A in vitro and in vivo. J Biol Chem. 285 (23), 17648-17661 (2010).
  13. Akil, O., et al. Localization of Synucleins in the Mammalian Cochlea. JARO. 9 (4), 452-463 (2008).
  14. Guardia-Laguarta, C., et al. alpha-Synuclein Is Localized to Mitochondria-Associated ER Membranes. J Neurosci. 34 (1), 249-259 (2014).
  15. Shibayama-Imazu, T., et al. Distribution of PNP 14 (beta-synuclein) in neuroendocrine tissues: localization in Sertoli cells. Mol Reprod Dev. 50 (2), 163-169 (1998).
  16. Goedert, M. Alpha-synuclein and neurodegenerative diseases. Nat Rev Neurosci. 2 (7), 492-501 (2001).
  17. Goedert, M., Spillantini, M. G., Del Tredici, K., Braak, H. 100 years of Lewy pathology. Nat Rev Neurol. 9 (1), 13-24 (2013).
  18. Alerte, T. N., et al. Alpha-synuclein aggregation alters tyrosine hydroxylase phosphorylation and immunoreactivity: lessons from viral transduction of knockout mice. Neurosci Lett. 435 (1), 24-29 (2008).
  19. Peng, X., Tehranian, R., Dietrich, P., Stefanis, L., Perez, R. G. Alpha-synuclein activation of protein phosphatase 2A reduces tyrosine hydroxylase phosphorylation in dopaminergic cells. J Cell Sci. 118 (Pt 15), 3523-3530 (2005).
  20. Perez, R. G., et al. A role for alpha-synuclein in the regulation of dopamine biosynthesis. J Neurosci. 22 (8), 3090-3099 (2002).
  21. Porras, J. L., Perez, R. G. Ch. III. Nova Publishers - Alpha-Synuclein. Kanowitz, H. C., Polizzi, M. , NOVA Science Publishers. 51-70 (2014).
  22. Tehranian, R., Montoya, S. E., Van Laar, A. D., Hastings, T. G., Perez, R. G. Alpha-synuclein inhibits aromatic amino acid decarboxylase activity in dopaminergic cells. J Neurochem. 99 (4), 1188-1196 (2006).
  23. Wu, J., et al. Lewy-like aggregation of alpha-synuclein reduces protein phosphatase 2A activity in vitro and in vivo. Neuroscience. 207, 288-297 (2012).
  24. Geng, X., et al. alpha-Synuclein binds the K(ATP) channel at insulin-secretory granules and inhibits insulin secretion. Am J Physiol Endocrinol Metab. 300 (2), E276-E286 (2011).
  25. Farrell, K. F., et al. Non-motor parkinsonian pathology in aging A53T alpha-synuclein mice is associated with progressive synucleinopathy and altered enzymatic function. J Neurochem. 128 (4), 536-546 (2014).
  26. Janssens, V., Goris, J. Protein phosphatase 2A: a highly regulated family of serine/threonine phosphatases implicated in cell growth and signalling. Biochem J. 353 (Pt 3), 417-439 (2001).
  27. Wlodarchak, N., Xing, Y. PP2A as a master regulator of the cell cycle. Critical reviews in biochemistry and molecular biology. 51 (3), 162-184 (2016).
  28. George, J. M. The synucleins. Genome Biol. 3 (1), (2002).
  29. Fathi, A. R., Krautheim, A., Lucke, S., Becker, K., Juergen Steinfelder, H. Nonradioactive technique to measure protein phosphatase 2A-like activity and its inhibition by drugs in cell extracts. Anal Biochem. 310 (2), 208-214 (2002).
  30. Hashimoto, M., et al. An antiaggregation gene therapy strategy for Lewy body disease utilizing beta-synuclein lentivirus in a transgenic model. Gene Ther. 11 (23), 1713-1723 (2004).
  31. Hashimoto, M., Rockenstein, E., Mante, M., Mallory, M., Masliah, E. beta-Synuclein inhibits alpha-synuclein aggregation: a possible role as an anti-parkinsonian factor. Neuron. 32 (2), 213-223 (2001).
  32. McAvoy, T., Nairn, A. C. Serine/threonine protein phosphatase assays. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 18, (2010).
  33. Anwar, S., et al. Functional alterations to the nigrostriatal system in mice lacking all three members of the synuclein family. J Neurosci. 31 (20), 7264-7274 (2011).
  34. Vargas-Medrano, J., et al. Novel FTY720-based compounds stimulate neurotrophin expression and phosphatase activity in dopaminergic cells. ACS Med Chem Lett. 5 (7), 782-786 (2014).
  35. Moorhead, G. Chapter 3, Small-molecule inhibitors of Ser/Thr protein phosphatases. Methods in Molecular Biology. 365, Protein Phosphatase Protocols, Humana Press. Totowa, New Jersey. 23-38 (2007).

Tags

Нейронауки выпуск 126 колориметрические пробирного дефосфорилирование малахит фосфат фосфатазы каталитическая субъединица PP2A рекомбинантных белков synucleins phosphopeptide треонин

Erratum

Formal Correction: Erratum: Recombinant α- β- and γ-Synucleins Stimulate Protein Phosphatase 2A Catalytic Subunit Activity in Cell Free Assays
Posted by JoVE Editors on 04/01/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Recombinant α- β- and γ-Synucleins Stimulate Protein Phosphatase 2A Catalytic Subunit Activity in Cell Free Assays

One of the authors' names was corrected from:

Brian Marcus

to:

Brian S. Marcus

Рекомбинантных α-β - и γ-Synucleins стимулировать активность белка фосфатазы 2A каталитическая субъединица в ячейке бесплатные анализы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lek, S., Vargas-Medrano, J.,… More

Lek, S., Vargas-Medrano, J., Villanueva, E., Marcus, B. S., Godfrey, W., Perez, R. G. Recombinant α- β- and γ-Synucleins Stimulate Protein Phosphatase 2A Catalytic Subunit Activity in Cell Free Assays. J. Vis. Exp. (126), e55361, doi:10.3791/55361 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter