axolotl 中的二维和三维超声心动图
Summary
在这里, 我们提出了超声心动图方案的二维和三维图像采集的轴突蜥蜴 (金银花) 的跳动的心脏, 在心脏再生的模型物种。这些方法允许在高时空分辨率下对心功能进行纵向评估。
Abstract
缺血性心脏病引起的心脏故障是一个重大挑战, 对心脏的再生疗法的需求很大。一些模型物种, 如斑马鱼和蜥蜴, 能够内在的心脏再生有希望为人类患者未来的再生疗法。为了评价心脏再生实验的结果, 必须监测心脏功能。蜥蜴 (a. mexicanum) 是再生生物学中一个成熟的模型物种, 达到可以评估心脏功能的大小。该方案的目的是建立方法, 重现性测量心脏功能在轴突超声心动图。介绍了不同麻醉剂 (苯并卡因、ms-222 和异丙酚) 的应用, 并介绍了二维超声心动图数据在麻醉和非麻醉轴突中的获取。三维 (3d) 心脏的二维超声心动图可以受到测量的不精确和主观性的影响, 并为缓解这种现象而采用的一种坚实的方法, 即内————————————————————————————————–证明。最后, 介绍了一种以非常高的时空分辨率和明显的血液与组织对比度获取轴突心脏跳动的三维超声心动图数据的方法。总体而言, 该协议应提供必要的方法来评估心脏功能和模型解剖, 以及流动动力学使用超声成像与应用于再生生物学和一般生理实验。
Introduction
缺血性心脏病是全世界 1,2人死亡的主要原因。尽管许多人由于快速和微调的医疗干预而在心肌梗死中存活下来, 但人类的缺血性事件往往会导致与肥大、电故障和心脏功能能力下降相关的纤维化疤痕.这种缺乏心脏组织再生潜力的情况在哺乳动物之间是共同的, 虽然有争议的哺乳动物心脏再生的说法已经报告, 这些已被限制在特定的小鼠菌株3,4和缺氧治疗小鼠5。因此, 心脏再生医学和生物学领域一般仅限于研究内在心脏再生现象的非哺乳动物动物模型。斑马鱼 (daio rerio)在过去的十年里被确立为最有特色的内在心脏再生模型 6,7,8,9,10.由于易于实验室维护, 生成时间短, 分子工具种类繁多, 斑马鱼很好地适应了心脏发育和再生的遗传和分子机制模型。然而, 斑马鱼心脏的微小尺寸使其不太适合功能评估, 复杂的外科手术和斑马鱼的非四足系统发育限制了在该物种的结果的合理推断, 从而证明使用其他较大的四足动物模型是合理的。脊椎动物心脏再生的最早模型之一是尾状两栖动物, 东方牛顿 (诺特西特)11, 一个物种仍然是一个有价值的模型 12。
近年来, 另一种尾状两栖动物–墨西哥轴突 (a. mexicanum) 作为一个大型 (高达100克的体重) 和高度实验室适应性的动物模型进入了这一领域, 用于广泛的再生学科, 包括肢体再生,脊髓损伤和心脏再生13,14,15,16, 17.axolotl 是高度友好的功能测量心脏使用高频超声心动图和心脏腹侧没有钙化结构允许超声成像与更低的图像伪影 (声学特别是阴影和混响) 比观察到的其他模型动物与钙化胸骨和肋骨。
下面的协议描述了几种不同的方法和制剂 (图 1,图 2), 以获得可重复的超声心动图测量轴突心脏在两个麻醉 (应用三种不同的麻醉剂:苯并被杀、ms-222 和异丙酚) 和非麻醉动物合两个 (图 3,图 4,图 5,图 6, 图 7,补充文件 1-12) 和三 (图 8,图 9, 补充文件 13-14) 空间尺寸。两栖动物的心脏是三室 (两个心房和一个心室)。心房由一个大的窦静脉提供, 脑室排空到动脉壁流出道 (图 2)。由于传统上最强调的是心室再生, 而不是心房6、7、8、9、10、11的恢复,12,14,17、本协议主要研究心室功能的测量。
两栖动物超声心动图在文献中没有得到很好的描述, 本文描述的2d 方法的发展是由于需要在给定的时间和实验环境下最好地代表跳动的轴突心脏的功能。因此, 这里描述的方法适用于心脏再生实验, 在这些实验中, 可以在再生过程中反复监测心脏功能。此外, 这些方法可应用于一般轴索替特的心脏生理实验, 或稍作修饰, 以跨越其他尾状物或无源两栖动物模型 (例如,)。轴索醇存在于几种不同的菌株和颜色变化 (例如, 野生型, 黑色素瘤, 白色, 白化病, 转基因白色与绿色荧光蛋白表达), 但这些特征不影响的兼容性轴索图尔与描述的协议。本文所述的获取三维超声心动图数据的方法是为临床超声开发的时空图像相关 (stic) 技术的改进版本, 以及前面所述的发展鸡的二次平均法。增强含有有核红细胞 18、19的物种软组织中的血斑信号。这种方法允许先进的心脏收缩模型和计算流体动力学的轴突心脏。
Protocol
Representative Results
Discussion
轴突和其他非哺乳动物物种中的超声心动图产生的数据与哺乳动物超声心动图有着根本不同的数据, 因为除成年哺乳动物外, 所有脊椎动物的红血球都有核化的性质。这导致一个明显的血液信号和较少血液对组织对比轴突超声心动图图像相比, 例如, 小鼠或人超声心动图。这可能会增加未处理单帧超声图像的图像分割难度, 因为很难区分血液和组织。然而, 这种现象可以是有利的, 当用于创建?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们要感谢奥胡斯大学生物科学研究所的卡斯珀·汉森提供了获取3d 超声心动图的电子微机械手并为其提供帮助。
Materials
| Axolotl (Ambystoma mexicanum) | Exoterra GmbH | N/A | All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP) can be applied for echocardiography |
| Vevo 2100 | Fujifilm, Visualsonics | Vevo 2100 | High frequency ultrasound system |
| MS700 | Fujifilm, Visualsonics | MS700 | 50 MHz center frequency, transducer |
| MS550s | Fujifilm, Visualsonics | MS550s | 40 MHz center frequency, transducer |
| Micromanipulator | Zeiss | NA | |
| Benzocain | Sigma-Aldrich | 94-09-7 | ethyl 4-aminobenzoate |
| MS-222 | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid |
| Propofol | B. Braun Medical A/S | NA | 2,6-diisopropylphenol |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | NaCl |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | CaCl2·2H2O |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 10034-99-8 | MgSO4·7H2O |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | KCl |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 67-64-1 | Propanone |
| Soft cloth | N/A | N/A | Any piece of soft cloth measuring appromixately 70 x 55 cm^2 e.g. a dish towel |
| Styrofoam block | N/A | N/A | Any piece of Styrofoam block measuring approximately 33 x 27 x 5 cm^3 e.g. a medium sized Styrofoam cooler lid |
| Plastic wrap | N/A | N/A | Any piece of plastic wrap e.g. food wrap |
| Tape | BSN Medical | 72359-02 | Leukoplast sleek |
| Kimwipes | Sigma-Aldrich | Z188956 | Kimwipes, disposable wipers |
| Excel 2010 | Microsoft | N/A | Excel 2010 or newer |
| ImageJ | National Institutes of Health | ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. | |
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