Échocardiographie 2D et 3D chez l’Axolotl (Ambystoma Mexicanum)

Summary

Nous présentons des protocoles d’échocardiographie pour l’acquisition d’images bidimensionnelles et tridimensionnelles de battre le cœur de la salamandre axolotl (Ambystoma mexicanum), une espèce de modèle dans la régénération du cœur. Ces méthodes permettent une évaluation longitudinale de la fonction cardiaque en haute résolution spatio-temporelle.

Abstract

Dysfonctionnement cardiaque par suite de maladie cardiaque ischémique est un défi majeur, et thérapies régénératives de coeur sont en forte demande. Quelques espèces de modèles tels que le poisson-zèbre et les salamandres qui sont capables de la régénération cardiaque intrinsèque sont prometteurs pour futures thérapies régénératives pour des patients humains. D’évaluer les résultats des expériences de cardioregenerative qu’il est impératif que la fonction cardiaque peut être surveillée. La salamandre axolotl (a. mexicanum) représente une espèce de modèle bien établi en biologie régénérative atteindre des tailles qui permet une évaluation de la fonction cardiaque. Ce protocole vise à établir des méthodes pour mesurer la fonction cardiaque chez l’axolotl en utilisant l’échocardiographie reproductible. L’application de différents anesthésiques (benzocaïne, MS-222 et propofol) est démontrée, et l’acquisition de deux dimensions (2D) données échocardiographiques axolotl non anesthésiés et anesthésiés est décrite. Échocardiographie 2D du cœur en trois dimensions (3D) peut souffrir de l’imprécision et la subjectivité de mesures et d’atténuer ce phénomène une solide méthode, à savoir intra/inter-operator/observateur analyse, pour mesurer et réduire au minimum ce biais est démontré. Enfin, on décrit une méthode pour acquérir des données échocardiographiques 3D de cœur axolotl en très haute résolution spatio-temporelle et avec un contraste prononcé sang-de-tissu. Dans l’ensemble, ce protocole devrait fournir les méthodes nécessaires pour évaluer la fonction cardiaque et l’anatomie du modèle et flux dynamique chez l’axolotl à l’aide de l’échographie avec des applications en biologie régénératrice et expériences physiologiques générales.

Introduction

Cardiopathie ischémique est des principales causes de décès dans le monde^1,2. Bien que beaucoup survécu à un infarctus du myocarde en raison de l’intervention médicale rapide et adaptée, incident ischémique chez les humains conduire souvent à des cicatrices fibreuses associée à une hypertrophie, panne électrique et une moindre capacité fonctionnelle du coeur . Ce manque de potentiel de régénération du tissu cardiaque est partagé chez les mammifères, et même si les revendications controversées de mammifères régénération cardiaque ont été signalées, ceux-ci ont été limités à certaines souches murines^3,4 et hypoxie traité souris⁵. Donc, le domaine de la biologie et la médecine régénérative cardiaque est généralement limité aux modèles animaux non-mammifère pour étudier les phénomènes de régénération cardiaque intrinsèque. Le poisson zèbre (Danio rerio) a été créé durant la dernière décennie que le modèle plus bien caractérisé pour coeur intrinsèque régénération^6,7,8,9,10 . En raison de la maintenance de laboratoire simple, un temps de génération court et un large éventail d’outils moléculaires disponibles, le poisson-zèbre est bien adapté comme un modèle pour les mécanismes génétiques et moléculaires qui sous-tendent le développement cardiaque et la régénération. Toutefois, les dimensions infimes du poisson-zèbre-coeur rendent que moins adaptée pour évaluation fonctionnelle et des interventions chirurgicales complexes et la phylogénie de non-tétrapode du poisson-zèbre limite l’extrapolation raisonnable des résultats dans cette espèce, ainsi justifiant le recours à d’autres modèles plus grands tétrapodes. Un des premiers modèles de régénération de coeur vertébrés est un amphibien noyau caudé, le Triton (Notophthalmus viridescens)¹¹, une espèce qui reste un modèle précieux¹².

Ces dernières années un autre noyau caudé amphibiens, l’axolotl mexicain (a. mexicanum) apparaisse comme un grand (jusqu’à 100 g du corps de masse) et hautement adaptable animal modèle de laboratoire pour un large éventail de disciplines régénératrices s’étendant sur la régénération des membres, la moelle épinière et la régénération cardiaque^{13,14,15,16,17}. L’axolotl est hautement susceptible de mesures fonctionnelles sur le cœur à l’aide d’échocardiographie de haute fréquence et de l’absence de structures calcifiées sur la face ventrale du coeur permet d’imagerie avec un niveau beaucoup plus faible d’artefacts d’image (acoustiques ultrasonore l’occultation et la réverbération en particulier) que celle observée chez d’autres animaux de modèle avec calcifiés sternum et côtes.

Le protocole suivant décrit plusieurs différentes méthodes et préparations (Figure 1, Figure 2) en vue d’acquérir des mesures échocardiographiques reproductibles sur le cœur de l’axolotl dans les deux anesthésiés (appliquer trois différents anesthésiques : benzocaïne, MS-222 et propofol) et non anesthésiés animaux en deux (Figure 3, Figure 4, Figure 5, Figure 6, Figure 7, Les fichiers supplémentaires 1-12) et trois (Figure 8, Figure 9, Fichiers supplémentaires 13-14) dimensions spatiales. Au cœur d’amphibien est trois chambres (deux oreillettes et un ventricule unique). Les oreillettes sont fournis par un grand sinus d’Arantius et le ventricule se jette dans le tube d’écoulement conus arteriosus (Figure 2). Étant donné que la plupart l’accent est traditionnellement placé sur la régénération ventriculaire et moins sur le recouvrement des oreillettes^{6,7,8,9,10,11 , 12 , 14 , 17}, le présent Protocole se concentre principalement sur les mesures de la fonction ventriculaire.

Échocardiographie amphibien n’est pas bien décrit dans la littérature, et le développement des méthodes 2D décrites dans le présent document ont été chassés par la nécessité de mieux représenter les fonctionnalités du cœur battant axolotl à un moment donné et le paramètre expérimental. Ainsi, les méthodes décrites ici sont appliquent dans les expériences régénératrice de cœur où fonction cardiaque peut être surveillée de façon répétée au cours d’un processus de régénération. En outre, les méthodes peuvent être appliqués dans des expériences de cardiophysiological sur l’axolotl en général ou légèrement modifiées pour couvrir d’autres modèles d’amphibiens anoures ou de noyau caudés (e.g.,Xenopus). L’axolotl existe dans plusieurs différentes souches et les variations de couleur (par exemple, type sauvage, mélanoïde, blanc, albino, transgénique blanc avec l’expression de la protéine fluorescence verte), cependant, ces caractéristiques n’affectent pas la compatibilité de la axolotl avec le protocole décrit. La méthode décrite ici pour acquérir des données échocardiographiques 3D est une version modifiée de la technique de corrélation (STIC) image spatio-temporelle développée pour l’échographie clinique et la quadratique moyenne méthode décrite précédemment dans le poulet en développement à améliorer le signal de taches de sang dans les tissus mous chez les espèces contenant des hématies nucléées^18,19. Cette méthode permet la modélisation avancée des contraction cardiaque et la dynamique des fluides calculée dans le coeur de l’axolotl.

Protocol

Les procédures menées dans le présent protocole étaient conformes à la législation danoise nationale pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et les expériences ont été approuvées par l’inspection d’expériences des animaux nationale danoise (protocole # 2015-15-0201-00615). 1. les préparatifs Préparer l’axolotl moyen. Appliquer l’eau du robinet non chimiquement traitée de haute qualité comme support de l’axolotl. Si ce n’est pas di…

Representative Results

Espace d’administration chez l’axolotl dépend de la taille de l’animal. Les animaux plus petits (2-20 g, 7 à 15 cm) aura un excès de liquide péricardique (qui apparaissent sombres en échocardiographie) entourant que le cardiaque chambers tandis que chez les plus grands animaux sexuellement matures (> 20 g, > 15 cm) les chambres occupera la plus grande partie de l’intrapericardial espace. Pour assurer la meilleure vue d’ensemble des résultats représentatifs d’échocardio…

Discussion

Échocardiographie chez l’axolotl et autres espèces de non-mammifère donne des données fondamentalement différentes échocardiographie chez les mammifères en raison du caractère nucléé de globules rouges chez tous les vertébrés à l’exception des mammifères adultes. Il en résulte un signal sang prononcé et moins de sang-de-tissu contraste en images échocardiographiques axolotl par rapport à la souris par exemple, ou échocardiographie humaine. Cela peut rendre segmentation d’image sur les é…

Materials

Axolotl (Ambystoma mexicanum)	Exoterra GmbH	N/A	All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP) can be applied for echocardiography
Vevo 2100	Fujifilm, Visualsonics	Vevo 2100	High frequency ultrasound system
MS700	Fujifilm, Visualsonics	MS700	50 MHz center frequency, transducer
MS550s	Fujifilm, Visualsonics	MS550s	40 MHz center frequency, transducer
Micromanipulator	Zeiss	NA
Benzocain	Sigma-Aldrich	94-09-7	ethyl 4-aminobenzoate
MS-222	Sigma-Aldrich	886-86-2	ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid
Propofol	B. Braun Medical A/S	NA	2,6-diisopropylphenol
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	7647-14-5	NaCl
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	10035-04-8	CaCl2·2H2O
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	10034-99-8	MgSO4·7H2O
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	7447-40-7	KCl
Acetone	Sigma-Aldrich	67-64-1	Propanone
Soft cloth	N/A	N/A	Any piece of soft cloth measuring appromixately 70 x 55 cm^2 e.g. a dish towel
Styrofoam block	N/A	N/A	Any piece of Styrofoam block measuring approximately 33 x 27 x 5 cm^3 e.g. a medium sized Styrofoam cooler lid
Plastic wrap	N/A	N/A	Any piece of plastic wrap e.g. food wrap
Tape	BSN Medical	72359-02	Leukoplast sleek
Kimwipes	Sigma-Aldrich	Z188956	Kimwipes, disposable wipers
Excel 2010	Microsoft	N/A	Excel 2010 or newer
ImageJ	National Institutes of Health		ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016.