אקוקרדיוגרפיה מימד ב אקסולוטל מקסיקני (Ambystoma Mexicanum)
Summary
כאן אנו מציגים אקוקרדיוגרפיה פרוטוקולים עבור ייבוא תמונות דו-ממדיות ותלת -ממדיים של הלב הפועם של הסלמנדרה אקסולוטל מקסיקני (Ambystoma mexicanum), זן מודל ב לב התחדשות. שיטות אלה מאפשרות האורך הערכה של תפקוד הלב ייתכן ברזולוציה גבוהה.
Abstract
תקלה הלב עקב מחלת לב איסכמית הוא אתגר גדול, טיפולים משובי ללב יש ביקוש גבוה. כמה מינים דגם כגון דג זברה, סלמנדרות המסוגלים התחדשות לב מהותי להחזיק הבטחה לעתיד טיפולים משובי עבור חולים אנושיים. כדי להעריך את התוצאה של הניסויים cardioregenerative זה הכרחי כי ניתן לנטר תפקוד הלב. הסלמנדרה אקסולוטל מקסיקני (mexicanum א) מייצגת זן ומבוססת מודל בביולוגיה regenerative להשיג בגדלים המאפשר להערכת תפקוד הלב. המטרה של פרוטוקול זה היא ליצור שיטות למדוד reproducibly תפקוד הלב אצל אקסולוטל מקסיקני בעזרת אקוקרדיוגרפיה. היישום של הרדמה שונים (בנזוקאין, MS-222 ו propofol) הוכח, הרכישה של מימדי בנתונים ומורדמת והן unanesthetized axolotls echocardiographic (2D) מתואר. אקוקרדיוגרפיה 2D של תלת מימד (3D) הלב יכול לסבול העוסקת, הסובייקטיביות של מדידות, וכדי להקל על תופעה זו שיטה מוצק, כלומר “אינטרה” / בין-operator/הצופה ניתוח, כדי למדוד ולצמצם את הנטיה הזו הפגינו. לבסוף, מתוארת שיטה להשיג נתונים תלת-ממדיים echocardiographic של הלב הפועם אקסולוטל מקסיקני ברזולוציה גבוהה מאוד ייתכן ועם ניגודיות דם-כדי-רקמת בולטת. בסך הכל, פרוטוקול זה צריך מספקים השיטות הדרושות כדי להעריך את תפקוד הלב ואת מודל אנטומיה, זרימה דינאמיקה של אקסולוטל מקסיקני באמצעות אולטראסאונד הדמיה עם יישומים בביולוגיה regenerative והן כללי הניסויים פיזיולוגיים.
Introduction
מחלת לב איסכמית הוא הגורם המוביל למוות ברחבי העולם1,2. למרות רבים לשרוד אוטם שריר הלב עקב התערבות רפואית מהירה, מכויל, אירועים איסכמיים בבני לעיתים קרובות להוביל שהותירה הצטלקות המשויך היפרטרופיה תקלה חשמלית, קיבולת תפקודית מופחתת של הלב . חוסר פוטנציאל הרגנרציה של רקמת הלב משותף בקרב יונקים, למרות טענות שנויות במחלוקת של התחדשות לב בתרבית של דווחו, אלה היו מוגבלים זנים מאתר מסוים3,4 , היפוקסיה מטופלים עכברים5. לפיכך, בתחום של רפואה רגנרטיבית לב וביולוגיה מוגבל בדרך כלל מודלים בעלי חיים שאינם מידע יונקים לחקור תופעות משובי הלב מהותי. דג זברה (רזבורה rerio) בעשור האחרון נוצרה כמו הדגם הכי טוב מאופיין הלב מהותי התחדשות6,7,8,9,10 . בשל תחזוקה קלה מעבדה, זמן דור קצר, מגוון רחב של כלים זמינים, דג זברה הוא מותאם כמודל עבור מנגנוני גנטית ומולקולרית שבבסיס לב התפתחות והתחדשות. עם זאת, ממדי הלב דג זברה דקה לעשות את זה שפחות מתאים להערכה תפקודית, פרוצדורות כירורגיות מסובכות ולא את האמיניות שאינם בעלי ארבע רגליים של דג זברה מגביל את אקסטרפולציה הגיונית של ממצאים של מין זה, ובכך המצדיקים את השימוש דגמים tetrapod גדולים אחרים. אחד המודלים המוקדמים של התחדשות לב חוליות היה על הידלדלות המזונבת, ניוט המזרחי (Notophthalmus viridescens)11, מין אשר נותר מודל ערך12.
בשנים האחרונות יש הידלדלות המזונבת אחר, אקסולוטל מקסיקני מקסיקני (mexicanum א) נכנס למקום כמו גדול (עד 100 גרם של הגוף מסה) ומודל מאוד מעבדה וישימה בבעלי חיים עבור מגוון רחב של משובי מתחומים שונים האיבר התחדשות, פגיעה בחוט השדרה, התחדשות לב13,14,15,16,17. אקסולוטל מקסיקני לבצע מדידות פונקציונלי על הלב בעזרת אקוקרדיוגרפיה בתדירות גבוהה ומאפשר העדר של מבנים מסויד בצד הגחוני של הלב סאונד הדמיה עם רמה נמוכה של התמונה חפצים (אקוסטי הוספת צל, ההד בפרט) מאשר אצל בעלי חיים אחרים דגם עם מסויד עצם החזה והצלעות.
פרוטוקול הבאה מתארת מספר שיטות שונות, ההכנות (איור 1, איור 2) לרכוש לשחזור מדידות echocardiographic על הלב אקסולוטל מקסיקני בשתי מרדימים (החלת שלושת הרדמה שונים: בנזוקאין, MS-222 ו propofol) ו- unanesthetized בעלי חיים שני (איור 3 איור 4, איור 5, 6 איור, איור 7, הקבצים המשלימים 1-12) ושלוש (איור 8, איור 9, הקבצים המשלימים 13-14) ממדים מרחביים. הלב דו-חיים הוא תלת תאיים (שני אטריה, של החדר ליחיד). אטריה מסופקים על-ידי venosus סינוס גדולים ונשפך הנוזלים אל מערכת יצוא כל arteriosus (איור 2). מאז רוב הדגש הוא באופן מסורתי שמוקם על התחדשות חדרית ופחות על החזרתה של אטריה6,7,8,9,10,11 , 12 , 14 , 17, פרוטוקול זה מתמקד בעיקר מדידות של תפקוד.
אקוקרדיוגרפיה דו-חיים אינה היטב תיאר בספרות, לפיתוח 2D בשיטות המתוארות במאמר זה גורשו על ידי הצורך לייצוג הטוב ביותר את הפונקציונליות של הלב הפועם אקסולוטל מקסיקני הגדרה ניסיוני ושעה נתון. לפיכך, בשיטות המתוארות כאן הינם חלים בניסויים משובי לב איפה תפקוד הלב ניתן שוב ושוב לנטר במהלך תהליך התחדשות. בנוסף, השיטות ניתן ליישם באופן כללי cardiophysiological ניסויים אקסולוטל מקסיקני או שונה במקצת כדי להתפרס המזונבת או anuran דו-חיים דגמים אחרים (e.g.,Xenopus). אקסולוטל מקסיקני קיים מספר זנים שונים, וריאציות צבע (למשל, wildtype, melanoid, לבן, לבקן, הטרנסגניים לבן עם ביטוי חלבון פלורסצנטיות ירוק), אולם מאפיינים אלו אינם משפיעים את התאימות של אקסולוטל מקסיקני עם פרוטוקול המתואר. השיטה המתוארת כאן כדי לרכוש נתונים תלת-ממדיים echocardiographic הוא גרסה מותאמת של טכניקת מתאם (STIC) התמונה ייתכן שפותחו עבור אולטרסאונד קלינית ואת הריבועית בממוצע בשיטה שתוארה לעיל התרנגולות המתפתח כדי להגביר את האות של דם ספאקלס ברקמות הרכות מינים המכיל תאי דם אדומים nucleated18,19. שיטה זו מאפשרת מידול מתקדמים של הידרודינמיקה מחושב בלב אקסולוטל מקסיקני להתכווצות הלב.
Protocol
Representative Results
Discussion
אקוקרדיוגרפיה את אקסולוטל מקסיקני, מינים אחרים שאינם מידע יונקים מניבה נתונים שונים באופן מהותי מאשר אקוקרדיוגרפיה יונקים בגלל אופיו nucleated של תאי דם אדומים גולגולת כל פרט יונקים בוגרים. התוצאה ב אות הדם בולטת ופחות דם-כדי-רקמת ניגודיות בתמונות echocardiographic אקסולוטל מקסיקני בהשוואה למשל,</e…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות קספר הנסן, מכון Bioscience, אוניברסיטת אהרחוס למתן גישה, בסיוע micromanipulator אלקטרוניים עבור רכישת echocardiographic תלת-ממד.
Materials
| Axolotl (Ambystoma mexicanum) | Exoterra GmbH | N/A | All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP) can be applied for echocardiography |
| Vevo 2100 | Fujifilm, Visualsonics | Vevo 2100 | High frequency ultrasound system |
| MS700 | Fujifilm, Visualsonics | MS700 | 50 MHz center frequency, transducer |
| MS550s | Fujifilm, Visualsonics | MS550s | 40 MHz center frequency, transducer |
| Micromanipulator | Zeiss | NA | |
| Benzocain | Sigma-Aldrich | 94-09-7 | ethyl 4-aminobenzoate |
| MS-222 | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid |
| Propofol | B. Braun Medical A/S | NA | 2,6-diisopropylphenol |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | NaCl |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | CaCl2·2H2O |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 10034-99-8 | MgSO4·7H2O |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | KCl |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 67-64-1 | Propanone |
| Soft cloth | N/A | N/A | Any piece of soft cloth measuring appromixately 70 x 55 cm^2 e.g. a dish towel |
| Styrofoam block | N/A | N/A | Any piece of Styrofoam block measuring approximately 33 x 27 x 5 cm^3 e.g. a medium sized Styrofoam cooler lid |
| Plastic wrap | N/A | N/A | Any piece of plastic wrap e.g. food wrap |
| Tape | BSN Medical | 72359-02 | Leukoplast sleek |
| Kimwipes | Sigma-Aldrich | Z188956 | Kimwipes, disposable wipers |
| Excel 2010 | Microsoft | N/A | Excel 2010 or newer |
| ImageJ | National Institutes of Health | ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. | |
Riferimenti
- Forouzanfar, M. H., et al. Assessing the Global Burden of Ischemic Heart Disease. Glob. Heart. 7, 331-342 (2012).
- Go, A. S., et al. Heart Disease and Stroke Statistics–2014 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 129, e28-e292 (2014).
- Leferovich, J. M., et al. Heart regeneration in adult MRL mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 9830-9835 (2001).
- Leferovich, J. M., Heber-Katz, E. The scarless heart. Semin. Cell Dev. Biol. 13, 327-333 (2002).
- Nakada, Y., et al. Hypoxia induces heart regeneration in adult mice. Nature. 541, 222-227 (2017).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298, 2188-2190 (2002).
- Chablais, F., Veit, J., Rainer, G., Jazwinska, A. The zebrafish heart regenerates after cryoinjury induced myocardial infarction. BMC Dev. Biol. 11, 21 (2011).
- Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends. Genet. 29, 611-620 (2013).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138, 1663-1674 (2011).
- Schnabel, K., Wu, C. C., Kurth, T., Weidinger, G. Regeneration of cryoinjury induced necrotic heart lesions in zebrafish is associated with epicardial activation and cardiomyocyte proliferation. PLoS One. 6 (4), e18503 (2011).
- Oberpriller, J. O., Oberpriller, J. C. Response of the adult newt ventricle to injury. J. Exp. Zool. 187, 249-260 (1974).
- Witman, N., Murtuza, B., Davis, B., Arner, A., Morrison, J. I. Recapitulation of developmental cardiogenesis governs the morphological and functional regeneration of adult newt hearts following injury. Dev. Biol. 354, 67-76 (2011).
- Gressens, J. An introduction to the Mexican axolotl (Ambystoma mexicanum). Lab Animal. 33, 41-47 (2004).
- Cano-Martínez, A., Vargas-González, A., Guarner-Lans, V., Prado-Zayago, E., León-Oleda, M., Nieto-Lima, B. Functional and structural regeneration in the axolotl heart (Ambystoma mexicanum) after partial ventricular amputation. Arch. Cardiol. Mex. 80, 79-86 (2010).
- McCusker, C., Gardiner, D. M. The axolotl model for regeneration and aging research: a mini-review. Gerontology. 57, 565-571 (2011).
- Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nat. Protoc. 9, 529-540 (2014).
- Nakamura, R., et al. Expression analysis of Baf60c during heart regeneration in axolotls and neonatal mice. Develop. Growth Differ. 58, 367-382 (2016).
- Tan, G. X. Y., Jamil, M., Tee, N. G. Z., Zhong, L., Yap, C. H. 3D Reconstruction of Chick Embryo Vascular Geometry Using Non-Invasive High-Frequency Ultrasound for Computational Fluid Dynamics. Ann. Biomed. Eng. 43, 2780-2793 (2015).
- Ho, S., Tan, G. X. Y., Foo, T. J., Phan-Thien, N., Yap, C. H. Organ Dynamics and Fluid Dynamics of the HH25 Chick Embryonic Cardiac Ventricle as Revealed by a Novel 4D High-Frequency Ultrasound Imaging Technique and Computational Flow Simulations. Ann. Biomed. Eng. , (2017).
- Wasmeier, G. H., et al. Reproducibility of transthoracic echocardiography in small animals using clinical equipment. Coron. Artery. Dis. 18, 283-291 (2007).
- Thygesen, M. M., Rasmussen, M. M., Madsen, J. G., Pedersen, M., Lauridsen, H. Propofol (2,6-diisopropylphenol) is an applicable immersion anesthetic in the axolotl with potential uses in hemodynamic and neurophysiological experiments. Regeneration. 4 (3), (2017).
