Ecocardiografía 2D y 3D en el ajolote (Ambystoma Mexicanum)

Summary

Aquí presentamos los protocolos de la ecocardiografía para la adquisición de la imagen bidimensional y tridimensional del corazón de la Salamandra axolotl (Ambystoma mexicanum), una especie de modelo en la regeneración del corazón. Estos métodos permiten una evaluación longitudinal de la función cardiaca con una alta resolución espaciotemporal.

Abstract

Mal funcionamiento cardiaco como resultado de enfermedad isquémica del corazón es un gran desafío, y terapias regenerativas del corazón están en alta demanda. Algunas especies de modelo como el pez cebra y salamandras que son capaces de regeneración intrínseca del corazón son prometedoras para futuras terapias regenerativas para pacientes humanos. Para evaluar el resultado de experimentos de cardioregenerative es imprescindible que puede controlarse la función cardíaca. La Salamandra axolotl (a. mexicanum) representa una especie de modelo bien establecido en la biología regenerativa alcanzar tamaños que permite la evaluación de la función cardiaca. El propósito del presente Protocolo es establecer métodos para reproducible medir función cardiaca en el ajolote mediante ecocardiografía. La aplicación de diferentes anestésicos (benzocaína, MS-222 y propofol) está demostrado, y se describe la adquisición de dos dimensiones (2D) datos ecocardiográficos en axolotl anestesiados y sin anestesiar. La ecocardiografía 2D del corazón tridimensional (3D) puede sufrir de imprecisión y subjetividad de las mediciones y para aliviar este fenómeno un método sólido, es decir, intra/inter-operator/observador análisis, para medir y reducir al mínimo este sesgo es demostrado. Por último, se describe un método para adquirir datos ecocardiográficos 3D del corazón de ajolote con una muy alta resolución espaciotemporal y pronunciado contraste de la sangre al tejido. En general, este protocolo debe proporcionar los métodos necesarios para evaluar la función cardiaca y la anatomía de la modelo y dinámica en el ajolote usando proyección de imagen de ultrasonido con aplicaciones en biología regenerativa y experimentos fisiológicos generales del flujo.

Introduction

Cardiopatía isquémica es la principal causa de muerte en todo el mundo^1,2. Aunque muchos sobreviven un infarto del miocardio debido a la intervención médica rápida y afinado, incidentes isquémicos en los seres humanos se conducen a menudo a cicatrices fibróticas asociadas con hipertrofia, avería eléctrica y una capacidad funcional disminuida del corazón . Esta falta de potencial regenerativo del tejido cardiaco es compartida entre mamíferos y aunque controvertidas afirmaciones de mamífera Regeneración cardiaca se han divulgado, estos se han limitado a cepas murinas específicas^3,4 y tratar la hipoxia ratones⁵. Así, el campo de la biología y la medicina regenerativa cardíaca es generalmente limitado a los modelos animales no mamíferos para estudiar los fenómenos regenerativos intrínsecos del corazón. El pez cebra (Danio rerio) en la última década se estableció como el modelo más bien caracterizado para corazón intrínseca regeneración^6,7,8,9,10 . Debido a mantenimiento de laboratorio fácil, un tiempo de generación corto y una amplia gama de herramientas moleculares disponibles, el pez cebra es adaptado como modelo de mecanismos genéticos y moleculares subyacentes el desarrollo cardíaco y regeneración. Sin embargo, las dimensiones minutos del corazón del pez cebra hacen menos adecuado para la evaluación funcional, y procedimientos quirúrgicos complicados y la filogenia no tetrápodo del pez cebra limita la extrapolación razonable de los resultados en esta especie, así justificar el uso de otros modelos más grandes tetrápodos. Uno de los primeros modelos de regeneración del corazón vertebrados fue un anfibio caudado, el newt del este (Notophthalmus viridescens)¹¹, una especie que sigue siendo un modelo valioso de¹².

En los últimos años otro anfibio caudado, el ajolote mexicano (a. mexicanum) ha entrado en la escena como un grande (hasta 100 g de cuerpo total) y altamente laboratorio adaptable modelo animal para una amplia gama de disciplinas regenerativas que regeneración de extremidades, lesión de la médula espinal y regeneración cardiaca^{13,14,15,16,17}. El ajolote es altamente susceptible de mediciones funcionales en el corazón utilizando la ecocardiografía de alta frecuencia y la ausencia de estructuras calcificadas en el lado ventral del corazón permite ultrasonido proyección de imagen con un nivel mucho más bajo de los artefactos de la imagen (acústicos sombras y reverberación en particular) que la observada en otros animales modelo calcificado esternón y las costillas.

El siguiente protocolo describe varios diferentes métodos y preparaciones (figura 1, figura 2) para la adquisición de mediciones ecocardiográficas reproducibles en el corazón de ajolote en ambos anestesiados (aplicación de tres diferentes anestésicos: benzocaína, MS-222 y propofol) y sin anestesiar animales en dos (figura 3, figura 4, figura 5, figura 6, figura 7, Archivos complementarios 1-12) y tres (figura 8, figura 9, Archivos complementarios 13-14) dimensiones espaciales. El corazón de los anfibios es tres cámaras (dos aurículas y un ventrículo único). Las aurículas son suministradas por un gran seno venoso y el ventrículo se vacía en el tracto de salida del cono arterioso (figura 2). Puesto que la mayoría es tradicionalmente sobre regeneración ventricular y menos en la recuperación de atria^{6,7,8,9,10,11 , 12 , 14 , 17}, este protocolo se centra principalmente en las mediciones de la función ventricular.

Ecocardiografía de anfibios no está bien descrita en la literatura, y el desarrollo de los métodos 2D se describe en este documento han sido expulsados por la necesidad de representar mejor la funcionalidad del corazón de ajolote en un momento dado y ajuste experimental. Así, los métodos aquí descritos son aplicables en los experimentos de regeneración de corazón donde función cardiaca puede ser supervisada varias veces sobre el curso de un proceso de regeneración. Además, los métodos pueden ser aplicados en experimentos de cardiophysiological con el ajolote en general o modificados levemente para abarcar otros modelos de anfibio caudados o anuros (e.g.,Xenopus). El Axolote existe en diversas variedades y variaciones del color (e.g., tipo salvaje, melanoid, blanco, albino, blanco transgénica con expresión de la proteína de fluorescencia verde), sin embargo estas características no afectan a la compatibilidad de la Axolote con el protocolo descrito. El método aquí descrito para adquirir datos ecocardiográficos 3D es una versión modificada de la técnica de correlación (STIC) imagen espacio-temporal para ultrasonido clínico y la cuadrática promedio método descrito anteriormente en el pollo en desarrollo a mejorar la señal de puntos de sangre en los tejidos blandos en las especies que contienen glóbulos rojos nucleados^18,19. Este método permite el modelado avanzado de la contracción cardiaca y computada dinámica de fluidos en el corazón de ajolote.

Protocol

Fueron los procedimientos realizados en el presente Protocolo con arreglo a la legislación danesa para el cuidado y uso de animales de laboratorio y los experimentos fueron aprobados por la inspección de experimentos nacional danés Animal (protocolo # 2015-15-0201-00615). 1. preparaciones Preparar axolotl medio. Aplique agua del grifo de alta calidad tratado químicamente no como medio de ajolote. Si esto no está disponible, aplicar solución de Holtfreter 40%. <li…

Representative Results

Espacio intrapericárdico en el axolotl es dependiente en el tamaño del animal. Animales más pequeños (2-20 g, 7-15 cm) tendrá un exceso de líquido pericárdico (aparece oscura en ecocardiografía) que rodean que el cardiaco cámaras mientras que en animales sexualmente maduros más grandes (> 20 g, > 15 cm) las cámaras ocupan la mayor parte de la intrapericardial espacio. Para proporcionar la mejor descripción para obtener resultados representativos de vistas ecocardiográficas de…

Discussion

Ecocardiografía en el ajolote y otras especies de animales no mamíferos produce fundamentalmente diferentes datos de la ecocardiografía de mamífero debido a la naturaleza nucleada de glóbulos rojos en todos los vertebrados excepto mamíferos adultos. Esto resulta en una señal de sangre pronunciado y menos sangre al tejido contraste en imágenes ecocardiográficas axolotl en comparación con e.g., ratón o humana ecocardiografía. Esto puede hacer segmentación de imágenes de ultrasonido solo más difícil…

Materials

Axolotl (Ambystoma mexicanum)	Exoterra GmbH	N/A	All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP) can be applied for echocardiography
Vevo 2100	Fujifilm, Visualsonics	Vevo 2100	High frequency ultrasound system
MS700	Fujifilm, Visualsonics	MS700	50 MHz center frequency, transducer
MS550s	Fujifilm, Visualsonics	MS550s	40 MHz center frequency, transducer
Micromanipulator	Zeiss	NA
Benzocain	Sigma-Aldrich	94-09-7	ethyl 4-aminobenzoate
MS-222	Sigma-Aldrich	886-86-2	ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid
Propofol	B. Braun Medical A/S	NA	2,6-diisopropylphenol
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	7647-14-5	NaCl
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	10035-04-8	CaCl2·2H2O
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	10034-99-8	MgSO4·7H2O
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	7447-40-7	KCl
Acetone	Sigma-Aldrich	67-64-1	Propanone
Soft cloth	N/A	N/A	Any piece of soft cloth measuring appromixately 70 x 55 cm^2 e.g. a dish towel
Styrofoam block	N/A	N/A	Any piece of Styrofoam block measuring approximately 33 x 27 x 5 cm^3 e.g. a medium sized Styrofoam cooler lid
Plastic wrap	N/A	N/A	Any piece of plastic wrap e.g. food wrap
Tape	BSN Medical	72359-02	Leukoplast sleek
Kimwipes	Sigma-Aldrich	Z188956	Kimwipes, disposable wipers
Excel 2010	Microsoft	N/A	Excel 2010 or newer
ImageJ	National Institutes of Health		ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016.