ウーパールーパー (アホロートル メキシコマンネングサ) で 2 D および 3 D 心エコー検査
Summary
アホロートル サラマンダー (アホロートル メキシコマンネングサ)、心臓再生のモデル動物の心臓の鼓動の二次元および三次元イメージ獲得のため心エコー検査プロトコルをご紹介します。高時空間分解能で心機能の縦断的評価を可能にするこれらのメソッド。
Abstract
虚血性心疾患により心臓の故障は大きな課題と心に再生治療は、高需要。ゼブラフィッシュと本質的な心を再生できるは、サンショウウオなど、いくつかのモデル種は、人間の患者、将来の再生治療のための約束を保持します。Cardioregenerative 実験の結果を評価するため、心臓機能を監視できることが不可欠です。アホロートル サラマンダー (A. メキシコマンネングサ) は、サイズを達成するため心機能の評価、再生の生物学の確立モデル種を表します。このプロトコルの目的アホロートル エコーによる心機能を再現性をもって測定する方法を確立することです。異なる麻酔 (プロポ フォール、MS-222、ベンゾカイン) のアプリケーションは、示されて、麻酔と無麻酔ウーパールーパーは絶滅の二次元 (2 D) 心エコー法によるデータの取得を説明しました。三次元 (3 D) 心の 2 D 心エコー検査は不正確さから苦しむことができるし、主観測定と堅実な方法すなわち内/間 operator/オブザーバー分析、測定、このバイアスを最小にするから、この現象を軽減するためには、示した。最後に、顕著な血液-組織コントラストと非常に高い時空間分解能でウーパールーパー心臓の 3 D 心エコー データを集録する方法を説明します。全体的にみて、このプロトコル心機能とモデルの解剖を評価するための必要なメソッドを提供し、超音波画像を用いた再生生物学で一般的な生理学的な実験アプリケーション アホロートルにおけるダイナミクスの流れ。
Introduction
虚血性心疾患は、死世界中1,2の主要な原因です。人間で虚血性の事件がしばしば肥大、電気の故障、および心の減少機能に関連付けられている線維性瘢痕につながるが、多くは、迅速かつきめ細かな医療介入による心筋梗塞を生き残るため、.心筋組織の再生の潜在性のこの欠乏は哺乳類の間で共有される、哺乳類心筋再生の物議を醸すクレームが報告されているが、これらは特定のマウス由来株3,4に限られていると低酸素状態は、マウス5を扱われます。したがって、心臓の再生医療と生物学の分野は一般に本質的な心の再生現象を研究する非哺乳類動物モデルに限定。ゼブラフィッシュ (動脈分布) 過去 10 年間として確立されている本質的な心の再生6,7,8,9,10 の最もよく特徴付けられたモデル.簡単な実験室のメンテナンス、短い世代時間と、利用可能な分子ツールの広い配列のためゼブラフィッシュは心臓発生と再生および遺伝学的および分子メカニズムのモデルとして適しています。ただし、ゼブラフィッシュ心臓の微小寸法機能の評価のために適していないし複雑な手術と、ゼブラフィッシュの非テトラポッド系統したがってこの種の所見の賢明な外挿を制限他の大きい四肢動物モデルの使用を正当化します。脊椎動物の心臓再生の最も初期のモデルの 1 つだった尾両生類, 東イモリ (Notophthalmus viridescens)11, 残っている貴重なモデル12種。
近年メキシコ アホロートル (A. メキシコマンネングサ) 別尾両生類、大きなシーンに入っている (100 g までの体の質量) と高所適応動物モデル スパニング肢の再生に、再生の分野の広い配列を脊髄損傷、心臓再生13,14,15,16,17。アホロートルは中心部の腹側に石灰化構造の不在は、超音波像のアーチファクト (音響のはるかに低いレベルで、高周波エコーによる心臓の機能の測定にシャドウと特に残響) 石灰化胸骨と肋骨の他のモデル動物での観測より。
次のプロトコルは、いくつかの別の方法と準備 (図 1、図 2) 麻酔の両方でウーパールーパーの心に再現できる心エコー計測について説明します (3 つの異なる麻酔薬を適用します。ベンゾカイン、MS-222、およびプロポ フォール) と 2 つの動物無麻酔 (図 3、図 4、図 5、図 6、図 7、補助ファイル 1-12) と 3 (図 8、図 9、 補助ファイル 13-14) 次元空間。両生類心臓は 3 chambered (2 つの心房、単心室)。大きなウナギ静脈洞によって心房と心室が動脈円錐流出路 (図 2) に注ぐ。最も重点を置いたが伝統的心室再生上に配置、アトリア6,7,8,9,10,11の回復が少ないので,12,14,17、このプロトコルは主に心機能の測定に焦点を当てください。
両生類の心エコー検査はよく文献に記載されている、本稿で説明している 2 D 法の開発によって駆動されている最高を表す必要アホロートル心臓の鼓動の機能与えられた時間と実験の設定で。したがって、ここで説明したメソッドは、心機能が繰り返し再生プロセスにわたって監視できます心臓再生実験に適用されます。さらに、メソッドをアホロートルの cardiophysiological 実験で一般に適用または他の尾または無尾両生類モデル (e.g.,Xenopus) をスパンするわずかに変更できます。アホロートル存在いくつかの異なる系統とカラー バリエーション (例えば、野生型、melanoid、白、アルビノ、緑色蛍光タンパク質の発現と形質転換白)、しかしこれらの特性の互換性を影響しません、記述のプロトコルとウーパールーパー。3 D 心エコーのデータを取得するここで説明する方法は臨床超音波と二次平均法にニワトリに記載されているために開発された時空間画像相関 (STIC) 法の修正版有核赤血球18,19を含む種の軟部組織に血の斑点の信号を強化します。このメソッドは、心筋収縮とウーパールーパーの心の計算の流体力学の高度なモデリングできます。
Protocol
Representative Results
Discussion
心エコー図、ウーパールーパーや他の非哺乳類種で大人の哺乳類を除くすべての脊椎動物の赤血球の核の性質のため哺乳類のエコーとは根本的に異なるデータが得られます。これは、結果、顕著な血信号と血液-組織コントラストはアホロートル心エコー画像などマウスまたは人間の心エコー図と比較して少ない。これできます画像の領域分割未処理の単一フレーム超音波画像上より難…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
カスパー ・ ハンセン、バイオ サイエンス研究所、3 D 心エコー取得へのアクセスと電子のマニピュレーターに援助を提供するためオーフス大学を認識したいと思います。
Materials
| Axolotl (Ambystoma mexicanum) | Exoterra GmbH | N/A | All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP) can be applied for echocardiography |
| Vevo 2100 | Fujifilm, Visualsonics | Vevo 2100 | High frequency ultrasound system |
| MS700 | Fujifilm, Visualsonics | MS700 | 50 MHz center frequency, transducer |
| MS550s | Fujifilm, Visualsonics | MS550s | 40 MHz center frequency, transducer |
| Micromanipulator | Zeiss | NA | |
| Benzocain | Sigma-Aldrich | 94-09-7 | ethyl 4-aminobenzoate |
| MS-222 | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid |
| Propofol | B. Braun Medical A/S | NA | 2,6-diisopropylphenol |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | NaCl |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | CaCl2·2H2O |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 10034-99-8 | MgSO4·7H2O |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | KCl |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 67-64-1 | Propanone |
| Soft cloth | N/A | N/A | Any piece of soft cloth measuring appromixately 70 x 55 cm^2 e.g. a dish towel |
| Styrofoam block | N/A | N/A | Any piece of Styrofoam block measuring approximately 33 x 27 x 5 cm^3 e.g. a medium sized Styrofoam cooler lid |
| Plastic wrap | N/A | N/A | Any piece of plastic wrap e.g. food wrap |
| Tape | BSN Medical | 72359-02 | Leukoplast sleek |
| Kimwipes | Sigma-Aldrich | Z188956 | Kimwipes, disposable wipers |
| Excel 2010 | Microsoft | N/A | Excel 2010 or newer |
| ImageJ | National Institutes of Health | ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. | |
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