2D и 3D эхокардиография в Аксолотля (Ambystoma Mexicanum)
Summary
Здесь мы представляем эхокардиография протоколы для двухмерных и трëхмерных изображений приобретение бьющееся сердце Аксолотль саламандра (Ambystoma mexicanum), модель виды в регенерации сердца. Эти методы позволяют продольные оценки функции сердца с высоким разрешением пространственно-временных.
Abstract
Сердца неисправности в результате ишемической болезни сердца является серьезной проблемой, и регенеративной терапии в сердце пользуются высоким спросом. Несколько видов модели как данио рерио и саламандры, которые способны внутренней сердце регенерации перспективны для будущих регенеративной терапии для человека пациентов. Чтобы оценить результаты экспериментов cardioregenerative важно, что функции сердца может контролироваться. Аксолотль саламандра (A. mexicanum) представляет устоявшихся моделей видов в регенеративных биологии, достижения размеров, что позволяет для оценки функции сердца. Целью настоящего Протокола является разработать методы измерения можно воспроизвести сердечной функции в Аксолотль, с помощью эхокардиографии. Применение различных анестетиков (бензокаин, MS-222 и пропофол) продемонстрировал, и приобретение двухмерных (2D) эхокардиографические данных в наркотизированных и наркозу axolotls описан. 2D эхокардиография сердца трехмерной (3D), могут страдать от неточностей и является субъективность измерений и для облегчения это явление сплошной метод, а именно intra/Межамери-операторами/наблюдателя анализа, измерения и свести к минимуму этот уклон продемонстрировал. Наконец описан метод для приобретения 3D эхокардиографические данных Аксолотль сердце с очень высоким разрешением пространственно-временных и с выраженным контраст крови в ткани. В целом этот протокол должен обеспечивать необходимые методы для оценки функции сердца и модель анатомии и потока динамика в Аксолотль, с помощью УЗИ с приложениями в регенеративных биологии и общие физиологических экспериментов.
Introduction
Ишемическая болезнь сердца является ведущей причиной смерти во всем мире1,2. Хотя многие выжить инфаркт миокарда за счет быстрого и точного медицинского вмешательства, ишемическая инцидентов в организме человека часто приводят к фиброзных рубцов, связанные с гипертрофией, электрические неисправности и снижение функциональных возможностей сердца . Это отсутствие регенеративного потенциала сердечной ткани распределяется среди млекопитающих и хотя спорные претензии млекопитающих сердечной регенерации сообщалось, они были ограничены конкретным мышиных штаммов3,4 и лечение гипоксии мышей5. Таким образом области сердца регенеративной медицины и биологии обычно ограничивается не млекопитающих животных моделей для изучения внутренней сердце регенеративные явления. Данио рерио (Danio рерио) в последнее десятилетие создана как наиболее хорошо характеризуется модель для внутренней сердце регенерации6,,78,9,10 . Благодаря легко лабораторных обслуживания, время коротких поколения и широкий спектр молекулярных инструментов, доступных, данио рерио хорошо приспособлены как модель генетические и молекулярные механизмы, лежащие в основе развития сердечной и регенерации. Однако минута размеры сердца данио рерио сделать его менее подходящими для функциональной оценки, и сложных хирургических процедур и не четвероногие филогении данио рерио ограничивает разумным экстраполяцию выводов этого вида, таким образом обоснование использования других крупных тетрапод моделей. Одним из ранних моделей позвоночных сердце регенерации был хвостатого амфибий, Восточной Тритон (полосатый viridescens)11, виды, которые остается ценным модель12.
В последние годы еще хвостатого амфибий, мексиканский Аксолотля (A. mexicanum) вышла сцена как большой (тела до 100 г массы) и высоко Лаборатория адаптации животных модель для широкий спектр восстановительных дисциплин, охватывающих регенерации конечностей, травмы спинного мозга и сердечной регенерации13,14,15,16,17. Аксолотль очень поддаются функциональных измерений на сердце с помощью эхокардиографии высокой частоты и отсутствие Кальцифицированный структур на вентральной стороне сердца позволяет для ультразвуковой визуализации с гораздо более низким уровнем изображения артефактов (акустическая затенение и реверберации в частности), чем в другие модели животных Кальцифицированный грудины и ребрами.
Следующий протокол описывает несколько различных методов и препаратов (рис. 1, рис. 2) получить воспроизводимые эхокардиографические измерений на сердце Аксолотль в обоих под наркозом (применяя три различных анестетики: бензокаин, MS-222 и пропофол) и наркозу животных в двух (рис. 3, рис. 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Дополнительные файлы 1-12) и три (Рисунок 8, Рисунок 9, Дополнительные файлы 13-14) пространственных измерениях. Амфибия сердца 3 камерные (два предсердия и желудочка один). Предсердия поставляются с большой venosus пазухи и желудочка впадает в урочище отток артериальный конус (рис. 2). Поскольку большинство внимание традиционно уделяется желудочков регенерации и меньше на восстановление предсердия6,,78,9,10,11 , 12 , 14 , 17, этот протокол в основном сосредоточена на измерение вентрикулярной функции.
Амфибия эхокардиографии не хорошо описан в литературе, и разработка 2D методов, описанных в этом документе были изгнаны, необходимость лучший представляют функциональность бьющееся сердце Аксолотль на данный момент времени и экспериментальной установки. Таким образом описанные здесь методы применяются в сердце регенеративной экспериментов где неоднократно сердечной функции могут контролироваться, в течение процесса регенерации. Кроме того методы можно в целом применяется в cardiophysiological экспериментах на Аксолотль или слегка изменены, чтобы охватывать другие хвостатого или anuran амфибия модели (e.g.,Xenopus). Аксолотль существует в нескольких различных сортов и оттенков (например, wildtype, melanoid, белый, альбинос, трансгенных белый с зеленым флуоресценции белков), однако эти характеристики не влияют на совместимость Аксолотль с описанной протоколом. Метод, описанный здесь приобрести 3D эхокардиографические данных представляет собой модифицированную версию метода корреляции (ЦУТИ) пространственно-временных изображений, разработанных для клинических УЗИ и квадратичные, метод, описанный ранее в развивающихся курица для усреднения усилить сигнал пятен крови в мягких тканях, содержащих ядерных клеток красной крови18,19видов. Этот метод позволяет для продвинутых моделирование сердечного сокращения и вычисляемые гидродинамики в самом Аксолотль.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эхокардиография в Аксолотль и других не млекопитающих видов дает принципиально различных данных, чем у млекопитающих эхокардиография из-за ядерных характер красных кровяных клеток в всех позвоночных за исключением взрослых млекопитающих. Это приводит к выраженным крови сигнал и мен?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы признать Kasper Хансен, Институт бионауки, Орхусе университет для обеспечения доступа и помощи с электронной микроманипулятор для 3D эхокардиографические приобретения.
Materials
| Axolotl (Ambystoma mexicanum) | Exoterra GmbH | N/A | All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP) can be applied for echocardiography |
| Vevo 2100 | Fujifilm, Visualsonics | Vevo 2100 | High frequency ultrasound system |
| MS700 | Fujifilm, Visualsonics | MS700 | 50 MHz center frequency, transducer |
| MS550s | Fujifilm, Visualsonics | MS550s | 40 MHz center frequency, transducer |
| Micromanipulator | Zeiss | NA | |
| Benzocain | Sigma-Aldrich | 94-09-7 | ethyl 4-aminobenzoate |
| MS-222 | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid |
| Propofol | B. Braun Medical A/S | NA | 2,6-diisopropylphenol |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | NaCl |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | CaCl2·2H2O |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 10034-99-8 | MgSO4·7H2O |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | KCl |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 67-64-1 | Propanone |
| Soft cloth | N/A | N/A | Any piece of soft cloth measuring appromixately 70 x 55 cm^2 e.g. a dish towel |
| Styrofoam block | N/A | N/A | Any piece of Styrofoam block measuring approximately 33 x 27 x 5 cm^3 e.g. a medium sized Styrofoam cooler lid |
| Plastic wrap | N/A | N/A | Any piece of plastic wrap e.g. food wrap |
| Tape | BSN Medical | 72359-02 | Leukoplast sleek |
| Kimwipes | Sigma-Aldrich | Z188956 | Kimwipes, disposable wipers |
| Excel 2010 | Microsoft | N/A | Excel 2010 or newer |
| ImageJ | National Institutes of Health | ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. | |
Riferimenti
- Forouzanfar, M. H., et al. Assessing the Global Burden of Ischemic Heart Disease. Glob. Heart. 7, 331-342 (2012).
- Go, A. S., et al. Heart Disease and Stroke Statistics–2014 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 129, e28-e292 (2014).
- Leferovich, J. M., et al. Heart regeneration in adult MRL mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 9830-9835 (2001).
- Leferovich, J. M., Heber-Katz, E. The scarless heart. Semin. Cell Dev. Biol. 13, 327-333 (2002).
- Nakada, Y., et al. Hypoxia induces heart regeneration in adult mice. Nature. 541, 222-227 (2017).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298, 2188-2190 (2002).
- Chablais, F., Veit, J., Rainer, G., Jazwinska, A. The zebrafish heart regenerates after cryoinjury induced myocardial infarction. BMC Dev. Biol. 11, 21 (2011).
- Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends. Genet. 29, 611-620 (2013).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138, 1663-1674 (2011).
- Schnabel, K., Wu, C. C., Kurth, T., Weidinger, G. Regeneration of cryoinjury induced necrotic heart lesions in zebrafish is associated with epicardial activation and cardiomyocyte proliferation. PLoS One. 6 (4), e18503 (2011).
- Oberpriller, J. O., Oberpriller, J. C. Response of the adult newt ventricle to injury. J. Exp. Zool. 187, 249-260 (1974).
- Witman, N., Murtuza, B., Davis, B., Arner, A., Morrison, J. I. Recapitulation of developmental cardiogenesis governs the morphological and functional regeneration of adult newt hearts following injury. Dev. Biol. 354, 67-76 (2011).
- Gressens, J. An introduction to the Mexican axolotl (Ambystoma mexicanum). Lab Animal. 33, 41-47 (2004).
- Cano-Martínez, A., Vargas-González, A., Guarner-Lans, V., Prado-Zayago, E., León-Oleda, M., Nieto-Lima, B. Functional and structural regeneration in the axolotl heart (Ambystoma mexicanum) after partial ventricular amputation. Arch. Cardiol. Mex. 80, 79-86 (2010).
- McCusker, C., Gardiner, D. M. The axolotl model for regeneration and aging research: a mini-review. Gerontology. 57, 565-571 (2011).
- Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nat. Protoc. 9, 529-540 (2014).
- Nakamura, R., et al. Expression analysis of Baf60c during heart regeneration in axolotls and neonatal mice. Develop. Growth Differ. 58, 367-382 (2016).
- Tan, G. X. Y., Jamil, M., Tee, N. G. Z., Zhong, L., Yap, C. H. 3D Reconstruction of Chick Embryo Vascular Geometry Using Non-Invasive High-Frequency Ultrasound for Computational Fluid Dynamics. Ann. Biomed. Eng. 43, 2780-2793 (2015).
- Ho, S., Tan, G. X. Y., Foo, T. J., Phan-Thien, N., Yap, C. H. Organ Dynamics and Fluid Dynamics of the HH25 Chick Embryonic Cardiac Ventricle as Revealed by a Novel 4D High-Frequency Ultrasound Imaging Technique and Computational Flow Simulations. Ann. Biomed. Eng. , (2017).
- Wasmeier, G. H., et al. Reproducibility of transthoracic echocardiography in small animals using clinical equipment. Coron. Artery. Dis. 18, 283-291 (2007).
- Thygesen, M. M., Rasmussen, M. M., Madsen, J. G., Pedersen, M., Lauridsen, H. Propofol (2,6-diisopropylphenol) is an applicable immersion anesthetic in the axolotl with potential uses in hemodynamic and neurophysiological experiments. Regeneration. 4 (3), (2017).
