2D und 3D Echokardiographie in der Axolotl (Z.B. geschieht)
Summary
Hier präsentieren wir Ihnen Echokardiographie Protokolle für zwei- und dreidimensionale Bilderfassung des schlagenden Herzens der Axolotl Salamander (Z.B. geschieht), ein Modell-Arten im Herzen Regeneration. Diese Methoden ermöglichen längs-Beurteilung der Herzfunktion mit einer hohen räumlich-zeitliche Auflösung.
Abstract
Kardiale Funktionsstörung durch ischämische Herzkrankheit ist eine große Herausforderung, und regenerative Therapien für das Herz sind sehr gefragt. Ein paar Modell-Arten wie Zebrafisch und Salamander, die inneren Herzen regenerieren können Versprechen für zukünftige regenerative Therapien für menschliche Patienten. Um das Ergebnis des Cardioregenerative Experimente zu bewerten ist es unerlässlich, dass Herz-Funktion überwacht werden kann. Der Axolotl Salamander (A. geschieht) stellt eine etablierte Modell Spezies in Regenerationsbiologie erreichen Größen, die für die Beurteilung der Herzfunktion ermöglicht. Dieses Protokoll soll Methoden zur Messung der Herzfunktion in der Axolotl mit Echokardiographie reproduzierbar zu etablieren. Die Anwendung von verschiedenen Anästhetika (Benzocain, MS-222 und Propofol) gezeigt, und die Übernahme von zweidimensionalen (2D) echokardiographische Daten bei narkotisierten und unanesthetized Axolotl beschrieben. 2D Echokardiographie des Herzens dreidimensionale (3D) leiden kann Ungenauigkeiten und Subjektivität von Messungen und zur Linderung dieses Phänomens eine solide Methode, nämlich Intra/inter-operator/Beobachter Analyse, zu messen und zu minimieren diese Vorspannung ist unter Beweis gestellt. Schließlich bezeichnet man eine Methode, echokardiographische 3D-Daten des Axolotl schlagenden Herzens mit einer sehr hohen räumlich-zeitliche Auflösung und mit ausgeprägten Gewebeprobe-Kontrast zu erwerben. Dieses Protokoll sollte insgesamt bieten die notwendigen Methoden zur Bewertung der Herzfunktion und Modell Anatomie und Dynamik in der Axolotl mit Ultraschall-Bildgebung mit Anwendungen in der Regenerationsbiologie und allgemeine physiologische Experimente zu fließen.
Introduction
Ischämischer Herzkrankheit ist eine führende Ursache von Tod weltweit1,2. Obwohl viele einen Herzinfarkt durch schnelle und fein abgestimmte medizinische Intervention überleben, führen ischämische Ereignisse beim Menschen oft zu fibrotische Narben verbunden mit Hypertrophie, elektrische Fehlfunktion und eine verminderte Leistungsfähigkeit des Herzens . Dieser Mangel an regenerative Potential von Herzgewebe wird unter Säugetieren aufgeteilt und obwohl umstrittene Forderungen der Säugetier-kardialen Regeneration gemeldet worden sind, wurden diese beschränkt sich auf bestimmte murinen Stämme3,4 und Hypoxie behandelt Mäuse5. So beschränkt sich das Feld der kardialen regenerativen Medizin und Biologie in der Regel auf nicht-Säugetier-Tiermodellen, inneren Herzen regenerative Phänomene zu studieren. Der Zebrabärbling (Danio Rerio) entstand im letzten Jahrzehnt sehr gut charakterisierten Vorbild für inneren Herzen Regeneration6,7,8,9,10 . Aufgrund von Wartungsarbeiten leicht Labor eine kurze Generationszeit und eine breite Palette von molekulare Werkzeuge zur Verfügung, ist der Zebrabärbling gut geeignet als Modell für die genetischen und molekularen Mechanismen, die kardiale Entwicklung und Regeneration. Aber die winzigen Abmessungen des Zebrafisch Herzens machen ihn weniger geeignet für funktionale Bewertung und komplizierte chirurgische Eingriffe und der nicht-Tetrapoden Phylogenie der Zebrafisch schränkt somit die vernünftige Extrapolation der Ergebnisse bei dieser Art die Verwendung von anderen größeren tetrapod Modelle zu rechtfertigen. Eines der frühesten Modelle der vertebrate Herz Regeneration war ein caudatus Amphibien, die östlichen Newt (Notophthalmus Viridescens)11, eine Spezies, die ein wertvolles Modell12bleibt.
In den letzten Jahren trat ein weiteres caudatus Amphibie, die mexikanischen Axolotl (A. geschieht) die Szene als eine große (bis zu 100 g Körper Masse) und hoch Labor anpassungsfähig Tiermodell für eine breite Palette von regenerativen Disziplinen spanning Glied Regeneration, Verletzungen des Rückenmarks und kardialen Regeneration13,14,15,16,17. Der Axolotl ist höchst zugänglicher Funktionsmessungen auf das Herz mit Hochfrequenz-Echokardiographie und das Fehlen von verkalkten Strukturen auf der ventralen Seite des Herzens ermöglicht Ultraschall-Bildgebung mit einem viel niedrigeren Niveau der Bildartefakte (akustische Shadowing und Nachhall im besonderen) als bei anderen Tieren Modells mit verkalkter Brustbein und Rippen zu beobachten.
Das folgende Protokoll beschreibt mehrere unterschiedliche Methoden und Vorbereitungen (Abbildung 1, Abbildung 2), reproduzierbare echokardiographische Messungen auf das Axolotl Herz in beiden betäubt zu erwerben (drei verschiedene Anästhetika anwenden: Benzocain, MS-222 und Propofol) und Tiere in zwei unanesthetized (Abbildung 3, Abbildung 4, Abb. 5, Abbildung 6, Abbildung 7, Ergänzende Dateien 1-12) und drei (Abbildung 8, Abbildung 9, Ergänzende Dateien 13-14) Raumdimensionen. Das Amphibien-Herz ist drei Kammern (zwei Atrien und einem einzigen Ventrikel). Die Vorhöfe sind mit einem großen Sinus Venosus versorgt und die Herzkammer mündet der Conus Arteriosus Ausflusstrakt (Abbildung 2). Da die meisten Schwerpunkt traditionell auf ventrikuläre Regeneration gelegt und weniger auf die Erholung der Vorhöfe6,7,8,9,10,11 liegt , 12 , 14 , 17, dieses Protokoll konzentriert sich hauptsächlich auf Messungen der linksventrikulären Funktion.
Amphibien-Echokardiographie ist nicht gut in der Literatur beschrieben, und die Entwicklung der 2D in diesem Artikel beschriebenen Methoden vertrieben wurden durch die Notwendigkeit, am besten repräsentieren die Funktionalität des schlagenden Herzens Axolotl zu einem bestimmten Zeitpunkt und experimentelle Einstellung. Somit gelten die hier beschriebenen Methoden im Herzen regenerative Experimente wo Herzfunktion wiederholt im Laufe einer Regenerationsprozess überwacht werden. Darüber hinaus lassen sich die Methoden im Allgemeinen in den Cardiophysiological Experimenten auf der Axolotl angewendet oder leicht modifiziert, um andere caudatus oder Anurenarten Amphibien Modelle (e.g.,Xenopus) umfassen. Der Axolotl existiert in mehreren Sorten und Farbvarianten (z.B., Wildtyp, Melanoid, weiß, Albino, transgenen weiß mit grünen Fluoreszenz-Protein-Expression), jedoch diese Eigenschaften berührt nicht die Kompatibilität der Axolotl mit dem beschriebenen Protokoll. Die Methode, die hier beschriebenen um echokardiographische 3D-Daten zu erwerben ist eine modifizierte Version der raumzeitlichen Bild Korrelation (STIC) Technik für klinische Ultraschall und die quadratische Mittelung in der entwickelnden Huhn, oben beschriebene Methode entwickelt verbessern Sie das Signal von Blut Flecken in Weichteilen bei Arten mit kernhaltigen roten Blutkörperchen18,19. Diese Methode ermöglicht erweiterte Modellierung von kardiale Kontraktion und berechnete Strömungsmechanik im Herzen Axolotl.
Protocol
Representative Results
Discussion
Echokardiographie in der Axolotl und anderen nicht-Säugetier-Arten ergibt sich grundlegend andere Daten als Säugetier Echokardiographie aufgrund der kernhaltigen Natur der roten Blutkörperchen bei allen Wirbeltieren außer Erwachsene Säugetiere. Dies führt zu eine ausgeprägte Blut-Signal und weniger Blut, Gewebe-Kontrast in Axolotl echokardiographischen Bilder im Vergleich zu z. B. Maus oder menschlichen Echokardiographie. Dies kann erschweren Bild Segmentierung auf unverarbeitete Einzelbild Ultraschallbil…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir würden gerne anerkennen, Kasper Hansen, Institut für Biowissenschaften, Universität Aarhus für die Zugang zu und Unterstützung bei der elektronischen Mikromanipulator 3D echokardiographische Erwerb.
Materials
| Axolotl (Ambystoma mexicanum) | Exoterra GmbH | N/A | All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP) can be applied for echocardiography |
| Vevo 2100 | Fujifilm, Visualsonics | Vevo 2100 | High frequency ultrasound system |
| MS700 | Fujifilm, Visualsonics | MS700 | 50 MHz center frequency, transducer |
| MS550s | Fujifilm, Visualsonics | MS550s | 40 MHz center frequency, transducer |
| Micromanipulator | Zeiss | NA | |
| Benzocain | Sigma-Aldrich | 94-09-7 | ethyl 4-aminobenzoate |
| MS-222 | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid |
| Propofol | B. Braun Medical A/S | NA | 2,6-diisopropylphenol |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | NaCl |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | CaCl2·2H2O |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 10034-99-8 | MgSO4·7H2O |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | KCl |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 67-64-1 | Propanone |
| Soft cloth | N/A | N/A | Any piece of soft cloth measuring appromixately 70 x 55 cm^2 e.g. a dish towel |
| Styrofoam block | N/A | N/A | Any piece of Styrofoam block measuring approximately 33 x 27 x 5 cm^3 e.g. a medium sized Styrofoam cooler lid |
| Plastic wrap | N/A | N/A | Any piece of plastic wrap e.g. food wrap |
| Tape | BSN Medical | 72359-02 | Leukoplast sleek |
| Kimwipes | Sigma-Aldrich | Z188956 | Kimwipes, disposable wipers |
| Excel 2010 | Microsoft | N/A | Excel 2010 or newer |
| ImageJ | National Institutes of Health | ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. | |
Riferimenti
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