2D- en 3D-echocardiografie in de Axolotl (Ambystoma Mexicanum)

Summary

Hier presenteren we echocardiografie protocollen voor tweedimensionale en driedimensionale Beeldacquisitie van het kloppende hart van de salamander axolotl (Ambystoma mexicanum), een soort model regeneratie van het hart. Deze methoden toestaan voor longitudinale evaluatie van de hartfunctie met een hoge resolutie van de spatio.

Abstract

Cardiale storing als gevolg van ischemische hartziekten is een belangrijke uitdaging, en regeneratieve therapie naar het hart zijn in hoge vraag. Een paar model soorten zoals zebravis en salamanders die kunnen intrinsieke hart regeneratie houdt belofte voor toekomstige regeneratieve therapieën voor menselijke patiënten. Om te evalueren van de resultaten van de experimenten van de cardioregenerative het absoluut noodzakelijk is dat de hartfunctie kan worden gecontroleerd. De axolotl salamander (A. mexicanum) vertegenwoordigt een reeds lang gevestigde model soort(en) in regeneratieve biologie maten te bereiken die het mogelijk voor de evaluatie van de hartfunctie maakt. Het doel van dit protocol is te voorzien in methoden voor het meten van reproducibly cardiale functie in de axolotl met echocardiografie. De toepassing van verschillende verdoving (benzocaïne, MS-222 en propofol) is aangetoond, en de verwerving van tweedimensionale (2D) echocardiographic gegevens in zowel de unanesthetized als de narcose axolotls wordt beschreven. 2D echocardiografie van het driedimensionale (3D) hart kan lijden aan onnauwkeurigheid en subjectiviteit van metingen, en om te verlichten dit verschijnsel een solide methode, namelijk intra/intersite-operator/waarnemer analyse, te meten en dit vooroordeel te minimaliseren is aangetoond. Tot slot, een methode om 3D echocardiographic gegevens van het kloppende axolotl hart bij een zeer hoge Spatio resolutie en met een uitgesproken bloed-naar-weefsel contrast te vergaren is beschreven. Over het geheel genomen moet dit protocol voorzien van de nodige methoden om hartfunctie en anatomie model te evalueren, en stromen van dynamiek in de axolotl met behulp van echografie imaging met toepassingen in zowel regeneratieve biologie en algemene fysiologische experimenten.

Introduction

Ischemische hartziekten is een belangrijke oorzaak van overlijden wereldwijd^1,2. Hoewel velen een hartinfarct als gevolg van snelle en verfijnd medische interventie overleven, leiden ischemische incidenten bij de mens vaak tot fibrotische littekenvorming gekoppeld aan hypertrofie, elektrische storing en een verminderde functionele capaciteit van het hart . Dit gebrek aan regeneratieve potentieel van cardiale weefsel wordt gedeeld door zoogdieren en hoewel controversiële claims van zoogdieren cardiale regeneratie hebben gemeld, deze zijn beperkt tot specifieke lymfkliertest stammen^3,4 en Hypoxie behandeld muizen⁵. Het gebied van cardiale regeneratieve geneeskunde en de biologie is dus over het algemeen beperkt tot niet-zoogdier diermodellen om intrinsieke hart regeneratieve verschijnselen bestuderen. De zebravissen (Danio rerio) is in het afgelopen decennium opgezet als de meest goed gekarakteriseerd model voor intrinsieke hart regeneratie^6,7,8,9,10 . Als gevolg van gemakkelijk laboratorium onderhoud, een korte generatietijd en een breed scala van moleculaire tools beschikbaar, is de zebravis geschikt als een model voor genetische en moleculaire mechanismen ten grondslag liggen aan de cardiale ontwikkeling en regeneratie. Echter de minieme afmetingen van de zebravis hart maken het die minder voor functionele evaluatie geschikt en gecompliceerde chirurgische procedures en de niet-viervoeters fylogenie van de zebravis beperkt de verstandige extrapolatie van de bevindingen in dit soort, dus het gebruik van andere grotere tetrapod modellen te rechtvaardigen. Een van de vroegste modellen van gewervelde hart regeneratie was een Spiegelse amfibieën, de Oost-newt (Notophthalmus viridescens)¹¹, een soort die een waardevolle model^{12 blijft}.

In de afgelopen jaren een andere Spiegelse amfibieën, de Mexicaanse axolotl (A. mexicanum) heeft ingevoerd de scène als een grote (tot 100 g van lichaam massa) en zeer laboratorium aanpasbaar diermodel voor een breed scala van regeneratieve disciplines ledemaat regeneratie, spanning dwarslaesie en cardiale regeneratie^{13,14,15,16,17}. De axolotl is zeer vatbaar voor functionele metingen op het hart met hoge frequentie echocardiografie en het ontbreken van kalkhoudend structuren aan de ventrale zijde van het hart zorgt voor echografie imaging met een veel lager niveau van afbeelding artefacten (akoestisch schaduwen en galm in het bijzonder) dan waargenomen in andere dieren model met kalkhoudend borstbeen en ribben.

Het volgende protocol beschrijft diverse verschillende methoden en preparaten (Figuur 1, Figuur 2) te verwerven reproduceerbaar echocardiographic metingen op de axolotl hart in beide verdoofd (drie verschillende verdoving toe te passen: Benzocaïne, MS-222 en propofol) en dieren in twee unanesthetized (Figuur 3, Figuur 4 Figuur 5, Figuur 6, Figuur 7, Aanvullende bestanden 1-12) en drie (Figuur 8, Figuur 9, Aanvullende bestanden 13-14) ruimtelijke dimensies. Het hart van de amfibieën is drie-chambered (twee atria en een één ventrikel). De atria worden geleverd door een grote sinus venosus en het ventrikel uitmondt in de conus arteriosus uitstroom tractus (Figuur 2). Aangezien de meeste nadruk traditioneel geplaatste op ventriculaire regeneratie en minder op het herstel van de atria^{6,7,8,9,10,11 is , 12 , 14 , 17}, dit protocol is hoofdzakelijk gericht op metingen van ventriculaire functie.

Amfibieën echocardiografie is niet goed beschreven in de literatuur, en de ontwikkeling van de 2D methoden die worden beschreven in dit document zijn verdreven door de noodzaak om de beste vertegenwoordigen de functionaliteit van de axolotl kloppend hart op een bepaald moment en experimentele setting. Dus zijn de hier beschreven methoden toepassing in hart regeneratieve experimenten waar hartfunctie herhaaldelijk in de loop van een regeneratieproces kan worden gecontroleerd. Bovendien kunnen de methoden worden toegepast in cardiophysiological experimenten op de axolotl in het algemeen of enigszins gewijzigd om het beslaan van andere Spiegelse of anuran wormsalamanders modellen (e.g.,Xenopus). De axolotl bestaat in diverse verschillende stammen en kleurvariaties (bijvoorbeeldwildtype, melanoid, witte, albino, transgene wit met groene fluorescentie eiwit expressie), echter deze kenmerken hebben geen invloed op de verenigbaarheid van de Axolotl met het protocol beschreven. De hier beschreven te verwerven van 3D-gegevens van de echocardiographic methode is een gewijzigde versie van de spatio afbeelding correlatie (STIC) techniek ontwikkeld voor het klinische echografie en de kwadratische gemiddeld in de ontwikkelingslanden kip aan eerder beschreven methode verbeteren van het signaal van bloed spikkels in zachte weefsels in soorten met genucleëerde rode bloedcellen^18,19. Deze methode zorgt voor geavanceerde modellering van de cardiale contractie en berekende fluid dynamics in het hart van de axolotl.

Protocol

De procedures in dit protocol uitgevoerd werden volgens de Deense nationale wetgeving voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en de experimenten zijn goedgekeurd door de Deense nationale dier experimenten inspectie (protocol # 2015-15-0201-00615). 1. voorbereiding Axolotl bereiden medium. Toepassing van hoge kwaliteit niet-chemisch behandeld leidingwater als axolotl medium. Als dit niet beschikbaar is, 40% Holtfreter de oplossing toepassen. Bereiden van 4…

Representative Results

Intrapericardial ruimte in de axolotl is afhankelijk van de grootte van het dier. Kleinere dieren (2-20 g, 7-15 cm) zal moeten excess pericardvocht vloeistof (verschijnt donkere in echocardiografie) rondom die de cardiale chambers overwegende dat in grotere seksueel volwassen dieren (> 20 g, > 15 cm) de kamers allermeest naar de intrapericardial bezetten zal ruimte. Om het beste overzicht voor representatieve resultaten van echocardiographic gedachten van het hart van de axolotl, werd een…

Discussion

Echocardiografie in de axolotl en andere soorten bij niet-zoogdieren levert fundamenteel verschillend gegevens dan zoogdieren echocardiografie vanwege het genucleëerde karakter van rode bloedcellen in alle gewervelden behalve volwassen zoogdieren. Dit resulteert in een uitgesproken bloed signaal en minder bloed-naar-weefsel contrast in axolotl echocardiographic beelden in vergelijking met bijvoorbeeld, muis of menselijke echocardiografie. Dit kan bemoeilijken beeldsegmentatie op onverwerkte één frame echograf…

Materials

Axolotl (Ambystoma mexicanum)	Exoterra GmbH	N/A	All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP) can be applied for echocardiography
Vevo 2100	Fujifilm, Visualsonics	Vevo 2100	High frequency ultrasound system
MS700	Fujifilm, Visualsonics	MS700	50 MHz center frequency, transducer
MS550s	Fujifilm, Visualsonics	MS550s	40 MHz center frequency, transducer
Micromanipulator	Zeiss	NA
Benzocain	Sigma-Aldrich	94-09-7	ethyl 4-aminobenzoate
MS-222	Sigma-Aldrich	886-86-2	ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid
Propofol	B. Braun Medical A/S	NA	2,6-diisopropylphenol
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	7647-14-5	NaCl
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	10035-04-8	CaCl2·2H2O
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	10034-99-8	MgSO4·7H2O
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	7447-40-7	KCl
Acetone	Sigma-Aldrich	67-64-1	Propanone
Soft cloth	N/A	N/A	Any piece of soft cloth measuring appromixately 70 x 55 cm^2 e.g. a dish towel
Styrofoam block	N/A	N/A	Any piece of Styrofoam block measuring approximately 33 x 27 x 5 cm^3 e.g. a medium sized Styrofoam cooler lid
Plastic wrap	N/A	N/A	Any piece of plastic wrap e.g. food wrap
Tape	BSN Medical	72359-02	Leukoplast sleek
Kimwipes	Sigma-Aldrich	Z188956	Kimwipes, disposable wipers
Excel 2010	Microsoft	N/A	Excel 2010 or newer
ImageJ	National Institutes of Health		ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016.