Ecocardiografia 2D e 3D no Axolotl (Ambystoma Mexicanum)

Summary

Aqui apresentamos os protocolos de ecocardiografia para aquisição de imagens bidimensionais e tridimensionais do coração pulsante de salamandra axolotl (Ambystoma mexicanum), uma espécie de modelo na regeneração do coração. Estes métodos permitem a avaliação longitudinal da função cardíaca em uma alta resolução spatiotemporal.

Abstract

Defeito cardíaco como resultado de doença isquêmica do coração é um grande desafio, e terapias regenerativas ao coração estão em alta demanda. Algumas espécies de modelo como zebrafish e salamandras que são capazes de regeneração intrínseca coração segura promessa futura das terapias regenerativas para pacientes humanos. Para avaliar o resultado das experiências de cardioregenerative, é imperativo que a função do coração pode ser monitorizada. A salamandra Ambystoma mexicanum (a. mexicanum) representa uma espécie de modelo bem estabelecida em biologia regenerativa atingir tamanhos que permite a avaliação da função cardíaca. O propósito do presente protocolo é estabelecer métodos para medir a função cardíaca nos axolotes usando ecocardiografia reproducibly. A aplicação de diferentes anestésicos (Benzocaína, MS-222 e propofol) é demonstrada, e a aquisição de dados de ecocardiográficas bidimensionais (2D) em axolotes anestesiados e sem anestesia é descrita. Ecocardiografia 2D do coração tridimensional (3D) pode sofrer de imprecisão e subjetividade das medições e para aliviar esse fenômeno um método sólido, ou seja análise intra/inter-operator/observador, para medir e minimizar esse viés é demonstrado. Finalmente, um método para adquirir dados ecocardiográficos 3D do coração axolote batendo em uma resolução muito alta spatiotemporal e com acentuado contraste de sangue-de-tecido é descrito. Globalmente, este protocolo deverá proporcionar os métodos necessários para avaliar a função cardíaca e anatomia do modelo e dinâmica nos axolotes utilizando imagens de ultra-som com aplicações em biologia regenerativa e experiências fisiológicas gerais de fluxo.

Introduction

Doença isquêmica do coração é das principais causas de morte em todo o mundo^1,2. Embora muitos sobrevivem a um infarto do miocárdio devido à intervenção médica rápida e aperfeiçoá-lo, incidentes isquêmicas em seres humanos, muitas vezes, levar a cicatrizes fibróticas associadas a hipertrofia, mau funcionamento elétrico e uma reduzida capacidade funcional do coração . Esta falta de potencial regenerativo do tecido cardíaco é compartilhada entre os mamíferos e embora controversas declarações de mamíferos regeneração cardíaca têm sido relatadas, estas foram limitadas ao cepas específicas de murino^3,4 e ratos de hipóxia tratada⁵. Assim, o campo da biologia e medicina regenerativa cardíaca é geralmente limitado a modelos animais não-mamíferos para estudar fenômenos regenerativos intrínseca do coração. O peixe-zebra (Danio rerio) na última década foi estabelecido como o modelo mais bem caracterizado para coração intrínseca regeneração^6,7,8,9,10 . Devido à manutenção do laboratório fácil, um tempo de geração curto e um vasto leque de ferramentas moleculares disponíveis, o zebrafish está bem adaptado como um modelo para mecanismos genéticos e moleculares subjacentes cardíaco desenvolvimento e regeneração. No entanto, as dimensões minutos do coração zebrafish torná-lo que menos adequado para a avaliação funcional e complicados procedimentos cirúrgicos e a não-tetrápode filogenia do zebrafish limita a extrapolação razoável das conclusões nesta espécie, assim justificando o uso de outros modelos maiores de tetrápodes. Um dos primeiros modelos de regeneração de coração de vertebrados foi um anfíbio caudado, o Tritão Oriental (Notophthalmus viridescens)¹¹, uma espécie que continua a ser um modelo valioso¹².

Nos últimos anos outro anfíbio caudado, o axolotl mexicano (a. mexicanum) entrou em cena como uma grande (até 100 g de corpo em massa) e altamente laboratório adaptável modelo animal para uma ampla gama de disciplinas regenerativas, abrangendo a regeneração de membro, lesão da medula espinhal e regeneração cardíaca^{13,14,15,16,17}. O axolotl é altamente passível de medidas funcionais sobre o coração, usando a alta frequência ecocardiografia e ultra-som de imagem com um nível muito inferior de artefatos de imagem (acústicos permite a ausência de estruturas calcificadas no lado ventral do coração sombreamento e reverberação em particular) do que o observado em outros animais modelo com calcificada esterno e costelas.

O protocolo seguinte descreve vários métodos diferentes e preparações (Figura 1, Figura 2) para adquirir reprodutíveis ecocardiográficas medições no coração axolote em ambos anestesiados (aplicar três diferentes anestésicos: benzocaína, MS-222 e propofol) e sem anestesia animais em dois (Figura 3, Figura 4, Figura 5, Figura 6, Figura 7, Arquivos complementares 1-12) e três (Figura 8, Figura 9, Arquivos complementares 13-14) dimensões espaciais. O coração dos anfíbios é três câmaras (dois átrios e um ventrículo único). Os átrios são fornecidos por um grande seio venoso e o ventrículo deságua o tracto de saída do conus arteriosus (Figura 2). Uma vez que mais ênfase é tradicionalmente colocado na regeneração ventricular e menos sobre a recuperação dos átrios^{6,7,8,9,10,11 , 12 , 14 , 17}, este protocolo centra-se principalmente em medições da função ventricular.

Ecocardiografia de anfíbios não é bem descrita na literatura, e o desenvolvimento dos métodos 2D descritas neste documento foram dirigidos pela necessidade de melhor representam a funcionalidade do coração batendo axolote em um determinado momento e configuração experimental. Assim, os métodos descritos aqui são aplicáveis em experiências regenerativas de coração onde função cardíaca pode ser monitorizada repetidamente ao longo de um processo de regeneração. Além disso, os métodos podem ser aplicados em experimentos de cardiophysiological sobre o axolote em geral ou ligeiramente modificados para abranger outros modelos de anfíbio caudados ou anfíbios anuros (e.g.,Xenopus). O axolote existe em várias cepas diferentes e variações de cor (por exemplo, sua, babão, branco, albino, branco transgénico com expressão de proteínas fluorescência verde), no entanto, estas características não afetar a compatibilidade do Ambystoma mexicanum com o protocolo descrito. O método descrito aqui para adquirir dados ecocardiográficos 3D é uma versão modificada da imagem spatiotemporal correlação (STIC) técnica desenvolvida por ultra-som clínico e a função quadrática média método descrito anteriormente no frango em desenvolvimento para aumentar o sinal de manchas de sangue em tecidos moles em espécies contendo hemácias nucleadas^18,19. Este método permite a modelagem avançada de contração cardíaca e computada dinâmica de fluidos no coração axolote.

Protocol

Os procedimentos realizados neste protocolo estavam em conformidade com a legislação nacional dinamarquesa para o cuidado e uso de animais de laboratório e as experiências foram aprovadas pela inspecção de experimentos de Animal nacional dinamarquês (protocolo # 15-00615-0201-2015). 1. preparações Preparar o axolote médio. Aplica água da torneira alta qualidade não-quimicamente tratada como meio de axolote. Se este não estiver disponível, aplica solução de 40%…

Representative Results

Espaço Intrapericárdica nos axolotes é dependente do tamanho do animal. Animais menores (2-20 g, 7-15 cm) terá um excesso de líquido pericárdico (aparecendo escuro em ecocardiografia) em torno que do cardíaco câmaras Considerando que em animais sexualmente maduros maiores (> 20 g, > 15 cm) as câmaras ocupará a maior parte do intrapericardial espaço. Para fornecer a melhor visão para resultados representativos de pontos de vista ecocardiográfica do coração axolote, um animal…

Discussion

Ecocardiografia no axolote e outras espécies não-mamíferos produz dados fundamentalmente diferentes do que a Ecocardiografia mamíferos devido à natureza nucleada das células vermelhas do sangue em todos os vertebrados exceto mamíferos adultos. Isso resulta em um sinal de sangue pronunciado e menos sangue-de-tecido contraste nas imagens ecocardiográficas axolote, em comparação com , por exemplo, mouse ou ecocardiografia humana. Isso pode dificultar segmentação de imagens em imagens de ultra-som não t…

Materials

Axolotl (Ambystoma mexicanum)	Exoterra GmbH	N/A	All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP) can be applied for echocardiography
Vevo 2100	Fujifilm, Visualsonics	Vevo 2100	High frequency ultrasound system
MS700	Fujifilm, Visualsonics	MS700	50 MHz center frequency, transducer
MS550s	Fujifilm, Visualsonics	MS550s	40 MHz center frequency, transducer
Micromanipulator	Zeiss	NA
Benzocain	Sigma-Aldrich	94-09-7	ethyl 4-aminobenzoate
MS-222	Sigma-Aldrich	886-86-2	ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid
Propofol	B. Braun Medical A/S	NA	2,6-diisopropylphenol
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	7647-14-5	NaCl
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	10035-04-8	CaCl2·2H2O
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	10034-99-8	MgSO4·7H2O
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	7447-40-7	KCl
Acetone	Sigma-Aldrich	67-64-1	Propanone
Soft cloth	N/A	N/A	Any piece of soft cloth measuring appromixately 70 x 55 cm^2 e.g. a dish towel
Styrofoam block	N/A	N/A	Any piece of Styrofoam block measuring approximately 33 x 27 x 5 cm^3 e.g. a medium sized Styrofoam cooler lid
Plastic wrap	N/A	N/A	Any piece of plastic wrap e.g. food wrap
Tape	BSN Medical	72359-02	Leukoplast sleek
Kimwipes	Sigma-Aldrich	Z188956	Kimwipes, disposable wipers
Excel 2010	Microsoft	N/A	Excel 2010 or newer
ImageJ	National Institutes of Health		ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016.