等温滴定量计测定酶稳定性
Summary
酶活性的热稳定性很容易用等温滴定量热法 (ITC) 测量。目前使用的大多数蛋白质稳定性检测测量蛋白质展开, 但没有提供有关酶活性的信息。通过国贸中心, 可以直接测定酶修饰对酶活性稳定性的影响。
Abstract
本研究展示了一种用等温滴定量法 (ITC) 测量酶活性稳定性的新方法。将底物溶液注入酶溶液后观察到的峰值热率与酶活性相关。随着时间的推移, 多次将底物注射到相同的酶溶液中, 表明酶活性的丧失。该检测是自主的, 只需要很少的人员时间, 适用于大多数培养基和酶。
Introduction
酶是能够催化各种有机反应的蛋白质。大多数酶在接近中性 ph 值的水溶液中发挥作用, 从而避免使用苛刻的溶剂。由于酶催化反应具有很高的选择性, 因此其副产品产生的副产品比酸和碱等非选择性催化剂少.这在食品制造中尤其重要, 因为在食品制造中, 所有的化学反应都必须进行, 这样最终产品对人类消费是安全的。目前, 酶被用于生产高果糖玉米糖浆2, 奶酪3, 啤酒4, 无乳糖牛奶5, 和其他重要的食品。虽然本文主要研究酶在食品工业中的应用, 但酶还有许多其他用途, 包括在绿色化学和药物合成方面。
酶的效用受到酶活性稳定性的限制, 而酶活性的稳定性取决于酶的三维结构的维持。酶结构可以通过修饰来稳定, 如聚乙二醇化6, 固定化上的固体支持7, 基因修饰8, 和配方。目前, 酶的稳定性通常是通过差示扫描量热法 (DSC) 和端点酶活性检测9来测量的。DSC 测量酶展开的温度;温度越高, 结构越稳定。然而, 活性的丧失往往发生在低于所需的温度, 以展开酶或域内的酶10。因此, DSC 不足以确定酶修饰是否能提高酶活性的稳定性。端点酶检测通常需要大量时间, 需要多个样品, 并且通常涉及不适用于高颜色或不透明溶液或悬浮液的耦合比色反应。
本研究展示了一种用等温滴定量法 (ITC) 直接测定酶活性稳定性的方法。国贸中心测量反应过程中释放或吸收的热量率。由于几乎所有反应都会产生或吸收热量, ITC 可用于大多数酶催化反应, 包括没有耦合反应或发生在牛奶等不透明介质中的反应。几十年来, 国贸中心一直被用来测量多种反应的化学动力学参数, 但这里介绍的协议侧重于使用 itc 来测量酶催化反应的峰值热率, 并表明酶活性是线性的与峰值热速率相关。ITC 对峰值热率的测量大多是自主的, 只需很少的人员时间来设置和分析。
Protocol
Representative Results
Discussion
此处描述的 ITC 酶稳定性分析的一个主要优点是自动化。一旦所有适当的缓冲液和解决方案都得到了, 每次检测的设置时间约为15分钟。相反, 传统的转化酶和乳糖酶活性检测需要约 2小时, 而进行检测的人持续参与, 许多酶活性检测需要大量的人小时。在以前的一份出版物中, 我们演示了 ITC 方法的数据与更传统的转化酶活性方法相比如何。
ITC 检测的另一个优?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
没有
Materials
| a-Lactose | Fisher Scientific | unknown (too old) | 500g |
| Sodium Acetate, Anhydrous 99% min | Alfa Aesar | A13184-30 | 250g |
| Lactase | MP Bio | 100780 | 5g |
| Hydrocholric Acid Solution, 1N | Fisher Scientific | SA48-500 | 500mL |
| Benchtop Meter- pH | VWR | 89231-622 | |
| Ethanol 70% | Fisher Scientific | BP8231GAL | 1gallon |
| Micro-90 | Fisher Scientific | NC024628 | 1L (cleaning solution) |
Riferimenti
- Anastas, P., Eghbali, N. Green chemistry: principles and practice. Chemical Society Reviews. 39 (1), 301-312 (2010).
- Jin, L. Q., et al. Immobilization of Recombinant Glucose Isomerase for Efficient Production of High Fructose Corn Syrup. Applied Biochemistry Biotechnoiogy. 183 (1), 293-306 (2017).
- Budak, &. #. 3. 5. 0. ;. &. #. 2. 1. 4. ;., Koçak, C., Bron, P. A., de Vries, R. P. . Microbial Cultures and Enzymes Dairy Technology. , 182-203 (2018).
- van Donkelaar, L. H. G., Mostert, J., Zisopoulos, F. K., Boom, R. M., van der Goot, A. J. The use of enzymes for beer brewing: Thermodynamic comparison on resource use. Energy. 115, 519-527 (2016).
- Rodriguez-Colinas, B., Fernandez-Arrojo, L., Ballesteros, A. O., Plou, F. J. Galactooligosaccharides formation during enzymatic hydrolysis of lactose: Towards a prebiotic-enriched milk. Food Chemistry. 145, 388-394 (2014).
- Lawrence, P. B., Price, J. L. How PEGylation influences protein conformational stability. Current Opinions in Chemical Biology. 34, 88-94 (2016).
- Bernal, C., Rodriguez, K., Martinez, R. Integrating enzyme immobilization and protein engineering: An alternative path for the development of novel and improved industrial biocatalysts. Biotechnology Advances. 36 (5), 1470-1480 (2018).
- Rigoldi, F., Donini, S., Redaelli, A., Parisini, E., Gautieri, A. Review: Engineering of thermostable enzymes for industrial applications. Applied Bioengeneering. 2 (1), 011501 (2018).
- Johnson, C. M. Differential scanning calorimetry as a tool for protein folding and stability. Archives of Biochemistry and Biophysics. 531 (1), 100-109 (2013).
- Chen, N. G., Gregory, K., Sun, Y., Golovlev, V. Transient model of thermal deactivation of enzymes. Biochimica et biophysica acta. 1814 (10), 1318-1324 (2011).
- Mason, M., et al. Calorimetric Methods for Measuring Stability and Reusability of Membrane Immobilized Enzymes. Jounal of Food Science. , (2017).
- Leksmono, C. S., et al. Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab. Journal of visualized experiments : Journal of Visual Experiments. (138), e54377 (2018).
