La stabilità termica dell'attività enzimatica è prontamente misurata tramite calorimetria isotermica di titolazione (ITC). La maggior parte delle analisi di stabilità di proteina attualmente utilizzato misura proteina sta svolgendo, ma non forniscono informazioni sull'attività enzimatica. ITC consente la determinazione diretta dell'effetto di modifiche di enzima sulla stabilità dell'attività enzimatica.
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Articolo metodologico
Misura di stabilità enzimatica di calorimetria isotermica di titolazione
In questo articolo
Sommario
Abstract
Questo lavoro dimostra un nuovo metodo per misurare la stabilità dell'attività enzimatica di calorimetria isotermica di titolazione (ITC). Il tasso di calore picco osservato dopo una singola iniezione di soluzione substrato in una soluzione di enzima è correlata con l'attività dell'enzima. Iniezioni multiple del substrato nella stessa soluzione enzima nel tempo mostrano la perdita di attività enzimatica. Il metodo è autonomo, che richiede pochissimo tempo personale ed è applicabile alla maggior parte dei media e degli enzimi.
Introduzione
Gli enzimi sono proteine in grado di catalizzare una vasta gamma di reazioni organiche. La maggior parte funzione di enzimi in soluzione acquosa al vicino a pH neutro, evitando l'uso di solventi aggressivi. A causa della loro elevata selettività, enzima catalizzata reazioni producono meno (in alcuni non casi nessun sottoprodotti) sottoprodotti rispetto catalizzatori non selettivi come acidi e basi1. Questo è particolarmente rilevante nella produzione di cibo dove tutte le reazioni chimiche devono essere fatto così il prodotto finale è sicuro per il consumo umano. Attualmente, gli enzimi sono usati per produrre alta fruttosio sciroppo di mais
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Protocollo
1. preparazione dei campioni
-
1.000 mL di tampone di acetato di sodio 0.1 M a pH 4,6
- Misurare da 800 mL di acqua distillata in un becher graduato da 1.000 mL.
- Pesare 8,2 g di acetato di sodio anidro e aggiungerlo al bicchiere.
- Porre il becher su un piatto di mescolare, inserire un bastoncino per mescolare nel bicchiere graduato, accendere la piastra di mescolare e mescolare fino a completa dissoluzione.
- Quando l'acetato di sodio anidro è completamente sciolto, misurare il pH della soluzione con un pHmetro calibrato.
- Aggiungere 1 M HCl o NaOH di conseguenza per ottenere il desiderato pH 4.....
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Risultati
I risultati rappresentativi nella Figura 1 e Figura 5 Visualizza dati da due enzimi, lattasi e invertasi. Lattasi e invertasi catalizzare l'idrolisi di un disaccaride in due monosaccaridi, endothermically ed esotermico, rispettivamente. Entrambe le reazioni enzimatiche sono state eseguite alle concentrazioni che ha precluso la saturazione dell'enzima.
I dati di lattasi dimostrano come ITC dati possono essere utilizzati per stimare la .......
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Discussione
Dei principali vantaggi dell'analisi di stabilità dell'enzima ITC descritto qui è l'automazione. Una volta che tutti i buffer appropriato e le soluzioni sono fatte, il tempo di set-up per ogni dosaggio è circa 15 min per la persona che fa il test. Al contrario, i dosaggi convenzionali per attività invertasi e lattasi richiedono circa 2 h con continuo coinvolgimento della persona facendo il test e molti saggi di attività enzimatica prendere considerevolmente più ore per persona. In una pubblicazione precedente, abbiamo di.......
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| A-Lattosio | Fisher Scientific | sconosciuto (troppo vecchio) | 500 g |
| Acetato di sodio, anidro 99% min | Alfa Aesar | A13184-30 | 250 g |
| Lattasi. | MP Bio | 100780 | 5g |
| Soluzione di acido idroconrico, 1N | Fisher Scientific | SA48-500 | da 500 ml |
| - pH | VWR | 89231-622 | |
| Etanolo 70% | Fisher Scientific | BP8231GAL | 1gallone |
| Micro-90 | Fisher Scientific | NC024628 | 1L (soluzione detergente) |
Riferimenti
- Anastas, P., Eghbali, N. Green chemistry: principles and practice. Chemical Society Reviews. 39 (1), 301-312 (2010).
- Jin, L. Q., et al. Immobilization of Recombinant Glucose Isomerase for Efficient Production of High Fructose Corn S....
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Ristampe e permessi
