מדידת אנזימטי יציבות על ידי טיטור איזותרמי Calorimetry
Summary
יציבות תרמית של פעילות אנזים נמדד בקלות על ידי טיטור איזותרמי calorimetry (ITC). כיום, רוב מבחני יציבות חלבון המשמש מדד חלבון התגלגלות, אבל אינם מספקים מידע אודות פעילות אנזימטיות. המרכז לטניס בישראל מאפשר קביעה ישירה ההשפעה של שינויים האנזים על היציבות של פעילות אנזים.
Abstract
עבודה זו מדגימה שיטה חדשה למדידת את היציבות של פעילות אנזים על ידי טיטור איזותרמי calorimetry (ITC). קצב חום שיא נצפתה לאחר זריקה אחת של הפתרון המצע לתוך פתרון אנזים הוא מתואם עם פעילות אנזים. זריקות מרובות של המצע לתוך אותו אנזים פתרון לאורך זמן להראות את אובדן פעילות אנזים. וזמינותו הוא אוטונומי, הדורשות כוח אדם מעט מאוד זמן, והוא החלים על מרבית התקשורת ואנזימים.
Introduction
אנזימים הם חלבונים מסוגל ותזרז מגוון רחב של תגובות אורגני. הפונקציה אנזימים רוב ב תמיסה מימית-ליד ה-pH נייטרלי וכך למנוע את השימוש בממיסים קשים. בגלל סלקטיביות גבוהה שלהם, אנזים מזורז ותגובות לייצר פחות (בחלק מהמקרים אין תוצרי לוואי) תוצרי לוואי מאשר זרזים לא בררניים כגון חומצות ובסיסים1. זה רלוונטי בעיקר בייצור מזון שבו כל תגובות כימיות חייב להיעשות כך המוצר הסופי הוא בטוח לצריכה אנושית. כיום, אנזימים משמשים להפקת פרוקטוז גבוהה סירופ תירס2, גבינה3, בירה4, לקטוז חלב5ומוצרי מזון חשוב. בעוד מאמר זה מתמקד אנזים לשימוש בתעשיית המזון, ישנם שימושים רבים ומגוונים עבור אנזימים כולל סינתזה התרופות, כימיה ירוקה.
השירות של אנזימים הוא מוגבל על ידי היציבות של פעילות אנזים, אשר תלויה שמירה על מבנה תלת-ממדי של האנזים. מבנה האנזים יכול התייצב על-ידי שינויים כגון PEGylation6, קיבעון על תמיכה מלאה7, שינויים גנטיים8ו פורמולציות. כיום, אנזים יציבות נמדד בדרך כלל על ידי calorimetry סריקה דיפרנציאלית (DSC), פעילות אנזים הקצה של מבחני9. DSC מודד את הטמפרטורה שבה מתגלה אנזים; גבוה יותר הטמפרטורה, המבנה יציבים יותר. עם זאת, אובדן של פעילות מתרחשת לעיתים קרובות בטמפרטורה נמוכה יותר מהנדרש כדי לגולל את אנזים או תחומים בתוך ה אנזים10. לכן, DSC אינה מספיקה לקבוע אם השינוי האנזים מגדילה את היציבות של פעילות אנזים. הקצה של אנזים מבחני הן בדרך כלל זמן אינטנסיבי, דורשים דוגמאות מרובות, לעתים קרובות כרוך תגובה ערכי צבע מוחלטים בשילוב אינה ישימה פתרונות מאוד צבעוניים או אטום או המתלים.
עבודה זו מדגימה שיטה למדידה ישירה היציבות של פעילות אנזים על ידי טיטור איזותרמי calorimetry (ITC). המרכז לטניס בישראל מודד את הקצב של חום שוחררו או נספג במהלך תגובה. מאז כמעט כל התגובות לייצר או קולטים חום, ITC יכול לשמש עבור רוב התגובות מזורז-אנזים, לרבות תגובות לא תגובה בשילוב או להופיע בתקשורת אטומים כגון חלב. ITC שימש במשך עשורים רבים כדי למדוד פרמטרים כימיים קינטי עבור סוגים רבים של תגובות, אבל פרוטוקול המובאת כאן מתמקד בשימוש ITC כדי למדוד את קצב חום שיא של תגובות מזורז-אנזים ומדגים כי פעילות אנזים הוא באופן ליניארי בקורלציה עם שיעור שיא החום. ITC מדידות של שיא החום המחירים בעיקר אוטונומי, דורשים מעט מאוד זמן צוות ההתקנה ולנתח.
Protocol
Representative Results
Discussion
היתרון העיקרי של ITC אנזים יציבות וזמינותו המתוארים כאן הוא אוטומציה. לאחר כל מאגרי המתאים ואת פתרונות נעשים, הגדרת זמן עבור כל assay הוא כ 15 דקות עבור האדם עושה את הבדיקה. לעומת זאת, מבחני קונבנציונליים עבור אינוורטאז ופעילות לקטאז דורשים בערך 2 h עם מעורבות מתמדת של האדם עושה את הבדיקה ולקחת ה?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אף אחד
Materials
| a-Lactose | Fisher Scientific | unknown (too old) | 500g |
| Sodium Acetate, Anhydrous 99% min | Alfa Aesar | A13184-30 | 250g |
| Lactase | MP Bio | 100780 | 5g |
| Hydrocholric Acid Solution, 1N | Fisher Scientific | SA48-500 | 500mL |
| Benchtop Meter- pH | VWR | 89231-622 | |
| Ethanol 70% | Fisher Scientific | BP8231GAL | 1gallon |
| Micro-90 | Fisher Scientific | NC024628 | 1L (cleaning solution) |
Riferimenti
- Anastas, P., Eghbali, N. Green chemistry: principles and practice. Chemical Society Reviews. 39 (1), 301-312 (2010).
- Jin, L. Q., et al. Immobilization of Recombinant Glucose Isomerase for Efficient Production of High Fructose Corn Syrup. Applied Biochemistry Biotechnoiogy. 183 (1), 293-306 (2017).
- Budak, &. #. 3. 5. 0. ;. &. #. 2. 1. 4. ;., Koçak, C., Bron, P. A., de Vries, R. P. . Microbial Cultures and Enzymes Dairy Technology. , 182-203 (2018).
- van Donkelaar, L. H. G., Mostert, J., Zisopoulos, F. K., Boom, R. M., van der Goot, A. J. The use of enzymes for beer brewing: Thermodynamic comparison on resource use. Energy. 115, 519-527 (2016).
- Rodriguez-Colinas, B., Fernandez-Arrojo, L., Ballesteros, A. O., Plou, F. J. Galactooligosaccharides formation during enzymatic hydrolysis of lactose: Towards a prebiotic-enriched milk. Food Chemistry. 145, 388-394 (2014).
- Lawrence, P. B., Price, J. L. How PEGylation influences protein conformational stability. Current Opinions in Chemical Biology. 34, 88-94 (2016).
- Bernal, C., Rodriguez, K., Martinez, R. Integrating enzyme immobilization and protein engineering: An alternative path for the development of novel and improved industrial biocatalysts. Biotechnology Advances. 36 (5), 1470-1480 (2018).
- Rigoldi, F., Donini, S., Redaelli, A., Parisini, E., Gautieri, A. Review: Engineering of thermostable enzymes for industrial applications. Applied Bioengeneering. 2 (1), 011501 (2018).
- Johnson, C. M. Differential scanning calorimetry as a tool for protein folding and stability. Archives of Biochemistry and Biophysics. 531 (1), 100-109 (2013).
- Chen, N. G., Gregory, K., Sun, Y., Golovlev, V. Transient model of thermal deactivation of enzymes. Biochimica et biophysica acta. 1814 (10), 1318-1324 (2011).
- Mason, M., et al. Calorimetric Methods for Measuring Stability and Reusability of Membrane Immobilized Enzymes. Jounal of Food Science. , (2017).
- Leksmono, C. S., et al. Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab. Journal of visualized experiments : Journal of Visual Experiments. (138), e54377 (2018).
