Misura di stabilità enzimatica di calorimetria isotermica di titolazione

Summary

La stabilità termica dell’attività enzimatica è prontamente misurata tramite calorimetria isotermica di titolazione (ITC). La maggior parte delle analisi di stabilità di proteina attualmente utilizzato misura proteina sta svolgendo, ma non forniscono informazioni sull’attività enzimatica. ITC consente la determinazione diretta dell’effetto di modifiche di enzima sulla stabilità dell’attività enzimatica.

Abstract

Questo lavoro dimostra un nuovo metodo per misurare la stabilità dell’attività enzimatica di calorimetria isotermica di titolazione (ITC). Il tasso di calore picco osservato dopo una singola iniezione di soluzione substrato in una soluzione di enzima è correlata con l’attività dell’enzima. Iniezioni multiple del substrato nella stessa soluzione enzima nel tempo mostrano la perdita di attività enzimatica. Il metodo è autonomo, che richiede pochissimo tempo personale ed è applicabile alla maggior parte dei media e degli enzimi.

Introduction

Gli enzimi sono proteine in grado di catalizzare una vasta gamma di reazioni organiche. La maggior parte funzione di enzimi in soluzione acquosa al vicino a pH neutro, evitando l’uso di solventi aggressivi. A causa della loro elevata selettività, enzima catalizzata reazioni producono meno (in alcuni non casi nessun sottoprodotti) sottoprodotti rispetto catalizzatori non selettivi come acidi e basi¹. Questo è particolarmente rilevante nella produzione di cibo dove tutte le reazioni chimiche devono essere fatto così il prodotto finale è sicuro per il consumo umano. Attualmente, gli enzimi sono usati per produrre alta fruttosio sciroppo di mais², formaggio³, birra⁴, privo di lattosio latte⁵e altri prodotti alimentari importanti. Mentre questa carta si concentra sull’uso degli enzimi nell’industria alimentare, ci sono molti altri usi per enzimi compreso nella sintesi chimica e droga verde.

L’utilità degli enzimi è limitata dalla stabilità dell’attività enzimatica, che dipende dal mantenimento della struttura tridimensionale dell’enzima. La struttura dell’enzima può essere stabilizzata tramite modifiche come PEGilazione⁶, immobilizzazione su un supporto solido⁷, modificazioni genetiche⁸e formulazioni. Attualmente, stabilità enzimatica è in genere misurata di calorimetria differenziale a scansione (DSC), e l’attività enzimatica endpoint saggi⁹. DSC misura la temperatura alla quale si dispiega un enzima; la temperatura è elevata, più stabile la struttura. Tuttavia, la perdita di attività si verifica spesso ad una temperatura inferiore rispetto a richiesta per spiegare l’enzima o domini all’interno degli enzimi¹⁰. Di conseguenza, DSC non è sufficiente per determinare se una modifica di enzima aumenta la stabilità dell’attività enzimatica. Analisi dell’enzima endpoint sono solitamente tempo intensivo, richiedono campioni multipli e spesso comportano una reazione colorimetrica accoppiata che non è applicabile a soluzioni altamente colorati o opachi o sospensioni.

Questo lavoro viene illustrato un metodo per la misura diretta della stabilità dell’attività dell’enzima tramite calorimetria isotermica di titolazione (ITC). ITC misura il tasso di calore rilasciato o assorbito nel corso di una reazione. Poiché quasi tutte le reazioni producono o assorbono calore, ITC può essere utilizzato per la maggior parte delle reazioni enzima-catalizzate, compreso le reazioni che non hanno una reazione accoppiata o verificarsi in mezzi opachi come il latte. ITC è stato utilizzato per molte decadi per misurare i parametri di cinetici chimici per molti tipi di reazioni, ma il protocollo qui presentato si concentra sull’utilizzo di ITC per misurare la velocità di picco di calore di reazioni enzima-catalizzate e dimostra che l’attività dell’enzima è linearmente correlato con il tasso di calore di picco. ITC misurazioni di velocità di picco di calore sono per lo più autonome e richiedono pochissimo tempo personale di installazione e analizzare.

Protocol

1. preparazione dei campioni 1.000 mL di tampone di acetato di sodio 0.1 M a pH 4,6 Misurare da 800 mL di acqua distillata in un becher graduato da 1.000 mL. Pesare 8,2 g di acetato di sodio anidro e aggiungerlo al bicchiere. Porre il becher su un piatto di mescolare, inserire un bastoncino per mescolare nel bicchiere graduato, accendere la piastra di mescolare e mescolare fino a completa dissoluzione. Quando l’acetato di sodio anidro è completamente…

Representative Results

I risultati rappresentativi nella Figura 1 e Figura 5 Visualizza dati da due enzimi, lattasi e invertasi. Lattasi e invertasi catalizzare l’idrolisi di un disaccaride in due monosaccaridi, endothermically ed esotermico, rispettivamente. Entrambe le reazioni enzimatiche sono state eseguite alle concentrazioni che ha precluso la saturazione dell’enzima. I dati di lattasi dimostrano come ITC dati possono essere utilizzati per stimare la …

Discussion

Dei principali vantaggi dell’analisi di stabilità dell’enzima ITC descritto qui è l’automazione. Una volta che tutti i buffer appropriato e le soluzioni sono fatte, il tempo di set-up per ogni dosaggio è circa 15 min per la persona che fa il test. Al contrario, i dosaggi convenzionali per attività invertasi e lattasi richiedono circa 2 h con continuo coinvolgimento della persona facendo il test e molti saggi di attività enzimatica prendere considerevolmente più ore per persona. In una pubblicazione precedente, abbi…

Materials

a-Lactose	Fisher Scientific	unknown (too old)	500g
Sodium Acetate, Anhydrous 99% min	Alfa Aesar	A13184-30	250g
Lactase	MP Bio	100780	5g
Hydrocholric Acid Solution, 1N	Fisher Scientific	SA48-500	500mL
Benchtop Meter- pH	VWR	89231-622
Ethanol 70%	Fisher Scientific	BP8231GAL	1gallon
Micro-90	Fisher Scientific	NC024628	1L (cleaning solution)