İzotermal titrasyon Kalorimetre tarafından ölçüm enzimatik istikrar
Summary
Enzim aktivitesinin termal kararlılık kolayca izotermal titrasyon Kalorimetre (ITC) tarafından ölçülür. Çoğu protein istikrar deneyleri şu anda ölçü protein unfolding kullanılan ancak enzimatik etkinliği hakkında bilgi sağlamaz. ITC enzim değişiklikleri istikrarı üzerinde enzim aktivitesinin etkisini doğrudan tayini sağlar.
Abstract
Bu eser izotermal titrasyon Kalorimetre (ITC) enzim aktivitesi kararlılığını ölçmek için yeni bir yöntem gösterir. Substrat çözeltisi tek bir enjeksiyon bir enzim çözüm içine enzim aktivitesi ile ilişkili sonra gözlenen en yüksek ısı hızı. Belgili tanımlık substrate zaman içinde birden çok enjeksiyonları aynı enzim çözüm içine kayıp enzim aktivitesinin göster. Tahlil gerektiren çok az personel zaman, özerk ve çoğu medya ve enzimler için geçerlidir.
Introduction
Proteinler organik reaksiyonlar geniş bir dizi katalizlerler yetenekli enzimlerdir. Çoğu enzim işlevinde yakınındaki nötr pH böylece sert çözücüler kullanımı kaçınarak sulu çözüm. Onların yüksek seçicilik nedeniyle daha az katalize enzim reaksiyonlar üretmek (bazı durumlarda hiçbir yan) yan asitler ve bazlar1gibi non-selektif katalizörler daha. Bu tüm kimyasal reaksiyonlar nihai ürün insan tüketimi için güvenli bu yüzden burada yapılması gereken gıda üretiminde özellikle önemlidir. Şu anda, enzimleri yüksek fruktoz mısır şurubu2, peynir3, bira4, laktozsuz süt5ve diğer önemli gıda ürünleri üretmek için kullanılır. Enzim kullanımı gıda sektöründe bu kağıt odaklanır iken enzimleri yeşil kimya ve ilaç sentezi de dahil olmak üzere çok çeşitli amaçlarla.
Belgili tanımlık yarar enzimlerin enzim üç boyutlu yapısını korumak üzerinde bağlıdır enzim aktivitesinin istikrar ile sınırlıdır. Enzim yapısı PEGylation6, immobilizasyon sağlam destek7, genetik değişiklikler8ve formülasyonları gibi değişiklikleri tarafından stabilize. Şu anda, enzim istikrar genellikle diferansiyel tarama Kalorimetre (DSC) tarafından ölçülür ve bitiş noktası enzim etkinliği9deneyleri. DSC hangi bir enzim izlerken sıcaklık ölçer; yüksek sıcaklık, daha istikrarlı bir yapı. Ancak, aktivite kaybı kez enzim veya etki alanları enzim10içinde açılmak için gerekenden daha düşük bir sıcaklıkta oluşur. Bu nedenle, DSC bir enzim değişiklik enzim aktivitesinin istikrar artıp artmadığını belirlemek için yeterli değildir. Bitiş noktası enzim deneyleri genellikle yoğun zaman, birden fazla örnekleri gerektirir ve genellikle son derece renkli veya opak çözümleri veya kullanılamaz hale için geçerli değildir eşleşmiş bir kolorimetrik reaksiyon içerir.
Bu eser bir enzim aktivitesi kararlılığını doğrudan ölçme izotermal titrasyon Kalorimetre (ITC) gösterir. ITC serbest veya bir tepki boyunca absorbe ısı hızını ölçer. Neredeyse tüm reaksiyonlar üretmek veya ısı emer, ITC eşleşmiş bir tepki veya oluşan reaksiyonlar süt gibi opak medya da dahil olmak üzere çoğu enzim katalize reaksiyonlar için kullanılabilir. ITC uzun yıllar çeşitli tepkiler için kimyasal kinetik parametreleri ölçmek için kullanılmıştır, ancak burada sunulan protokolü en yüksek ısı hızı enzim katalize reaksiyonların ölçmek için ITC kullanarak üzerinde odaklanır ve enzim aktivite doğrusal olduğunu gösterir en yüksek sıcaklık hızı ile ilişkili. En yüksek ısı hızını ITC ölçümleri çoğunlukla özerk ve kurulum ve analiz etmek için çok az personel zaman gerektirir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan ITC enzim istikrar tahlil önemli bir avantajı otomasyon sistemidir. Tüm uygun arabellek ve çözümleri yapıldıktan sonra her tahlil için hazırlık süresi yaklaşık 15dk için tahlil yapan biri var. Buna ek olarak, geleneksel deneyleri invertase ve laktaz aktivitesi için tahlil yapan kişinin sürekli katılımı ile yaklaşık 2 h gerektirir ve birçok enzimatik aktivite deneyleri miktardan çok daha fazla adam-saat değerlerini alır. Bir önceki yayında veri ITC yönteminden daha geleneks…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Hiçbiri
Materials
| a-Lactose | Fisher Scientific | unknown (too old) | 500g |
| Sodium Acetate, Anhydrous 99% min | Alfa Aesar | A13184-30 | 250g |
| Lactase | MP Bio | 100780 | 5g |
| Hydrocholric Acid Solution, 1N | Fisher Scientific | SA48-500 | 500mL |
| Benchtop Meter- pH | VWR | 89231-622 | |
| Ethanol 70% | Fisher Scientific | BP8231GAL | 1gallon |
| Micro-90 | Fisher Scientific | NC024628 | 1L (cleaning solution) |
Riferimenti
- Anastas, P., Eghbali, N. Green chemistry: principles and practice. Chemical Society Reviews. 39 (1), 301-312 (2010).
- Jin, L. Q., et al. Immobilization of Recombinant Glucose Isomerase for Efficient Production of High Fructose Corn Syrup. Applied Biochemistry Biotechnoiogy. 183 (1), 293-306 (2017).
- Budak, &. #. 3. 5. 0. ;. &. #. 2. 1. 4. ;., Koçak, C., Bron, P. A., de Vries, R. P. . Microbial Cultures and Enzymes Dairy Technology. , 182-203 (2018).
- van Donkelaar, L. H. G., Mostert, J., Zisopoulos, F. K., Boom, R. M., van der Goot, A. J. The use of enzymes for beer brewing: Thermodynamic comparison on resource use. Energy. 115, 519-527 (2016).
- Rodriguez-Colinas, B., Fernandez-Arrojo, L., Ballesteros, A. O., Plou, F. J. Galactooligosaccharides formation during enzymatic hydrolysis of lactose: Towards a prebiotic-enriched milk. Food Chemistry. 145, 388-394 (2014).
- Lawrence, P. B., Price, J. L. How PEGylation influences protein conformational stability. Current Opinions in Chemical Biology. 34, 88-94 (2016).
- Bernal, C., Rodriguez, K., Martinez, R. Integrating enzyme immobilization and protein engineering: An alternative path for the development of novel and improved industrial biocatalysts. Biotechnology Advances. 36 (5), 1470-1480 (2018).
- Rigoldi, F., Donini, S., Redaelli, A., Parisini, E., Gautieri, A. Review: Engineering of thermostable enzymes for industrial applications. Applied Bioengeneering. 2 (1), 011501 (2018).
- Johnson, C. M. Differential scanning calorimetry as a tool for protein folding and stability. Archives of Biochemistry and Biophysics. 531 (1), 100-109 (2013).
- Chen, N. G., Gregory, K., Sun, Y., Golovlev, V. Transient model of thermal deactivation of enzymes. Biochimica et biophysica acta. 1814 (10), 1318-1324 (2011).
- Mason, M., et al. Calorimetric Methods for Measuring Stability and Reusability of Membrane Immobilized Enzymes. Jounal of Food Science. , (2017).
- Leksmono, C. S., et al. Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab. Journal of visualized experiments : Journal of Visual Experiments. (138), e54377 (2018).
