Medição de estabilidade enzimática por calorimetria de Titulação Isotérmica

Summary

A estabilidade térmica da atividade da enzima é facilmente medida por calorimetria de titulação isotérmica (ITC). A maioria dos ensaios de estabilidade da proteína atualmente usado medida desdobramento de proteínas, mas não fornecem informações sobre a atividade enzimática. ITC permite a determinação direta do efeito das modificações da enzima na estabilidade da atividade enzimática.

Abstract

Este trabalho demonstra um novo método para medir a estabilidade da actividade enzimática por calorimetria de titulação isotérmica (ITC). A taxa de calor máxima observada após uma única injeção da solução de substrato em uma solução de enzima está correlacionada com a atividade da enzima. Múltiplas injeções do substrato para a mesma solução de enzima ao longo do tempo mostram a perda da atividade enzimática. O ensaio é autónomo, exigindo pouco tempo pessoal e é aplicável à maioria dos meios de comunicação e enzimas.

Introduction

As enzimas são proteínas capazes de catalisar uma ampla gama de reações orgânicas. Função da maioria das enzimas em solução aquosa a perto de pH neutro, evitando assim o uso de solventes ásperos. Por causa de sua alta seletividade, reacções enzimáticas catalisadas produzem menos (em alguns casos, sem subprodutos) subprodutos do que não-seletivo catalizadores tais como ácidos e bases¹. Isto é especialmente relevante na fabricação de alimentos onde todas as reações químicas devem ser feitas para que o produto final é seguro para consumo humano. Atualmente, as enzimas são usadas para produzir alta frutose xarope de milho², queijo³, cerveja⁴, leite sem lactose⁵e outros produtos alimentares importantes. Enquanto este artigo centra-se na utilização de enzimas na indústria de alimentos, existem muitos outros usos para enzimas, incluindo na síntese química e droga verde.

O utilitário de enzimas é limitado pela estabilidade da atividade enzimática, que depende de manter a estrutura tridimensional da enzima. A estrutura da enzima pode ser estabilizada por modificações como PEGylation⁶, imobilização em um suporte sólido⁷, as modificações genéticas⁸e formulações. Atualmente, a estabilidade da enzima é normalmente medida por Calorimetria exploratória diferencial (DSC) e⁹ensaios de atividade enzimática de ponto de extremidade. DSC mede a temperatura na qual uma enzima se desenrola; Quanto maior a temperatura, mais estável a estrutura. No entanto, a perda de atividade ocorre frequentemente em uma temperatura mais baixa do que o necessário para desdobrar a enzima ou domínios dentro do enzima¹⁰. Portanto, DSC não é suficiente para determinar se uma modificação da enzima aumenta a estabilidade da atividade enzimática. Ensaios enzimáticos de ponto de extremidade são geralmente tempo intensivo, requerem amostras múltiplas e muitas vezes envolvem uma reação colorimétrica acoplada que não é aplicável para soluções altamente coloridas ou opacas ou suspensões.

Este trabalho demonstra um método para a medição direta da estabilidade da atividade enzimática por calorimetria de titulação isotérmica (ITC). ITC mede a taxa de calor liberado ou absorvido durante o curso de uma reação. Desde que quase todas as reações produzem ou absorvem calor, ITC pode ser usado para a maioria das reações catalisada por enzimas, incluindo reações que não têm uma reação de acoplamento ou ocorrem em meios opacos, como leite. ITC tem sido usado por muitas décadas para medir parâmetros de cinéticos químicos para muitos tipos de reações, mas o protocolo apresentado aqui se concentra no uso ITC para medir a taxa de pico de calor de reações catalisadas por enzimas e demonstra que a atividade da enzima é linearmente correlacionada com a taxa de pico de calor. ITC medições de taxas de pico de calor na maior parte são autônomas e exigem muito pouco tempo pessoal para configurar e analisar.

Protocol

1. preparação de amostras 1.000 mL de tampão de acetato de sódio 0,1 M em pH 4,6 Medir a 800 mL de água destilada num copo graduado de 1.000 mL. Pesa 8,2 g de acetato de sódio anidro e adicioná-lo para o copo. Coloque o copo sobre um prato de agitar, colocar uma haste de agitação no copo medidor, ligue a placa de agitação e mexa até dissolver completamente. Quando o acetato de sódio anidro é completamente dissolvido, medir o pH da soluç…

Representative Results

Os resultados representativos na Figura 1 e Figura 5 mostram dados de duas enzimas, lactase e a invertase. Lactase e a invertase catalisam a hidrólise de um dissacarídeo em dois monossacarídeos, endothermically e exotermicamente, respectivamente. Ambas as reações enzimáticas foram executadas em concentrações que impediam a saturação da enzima. Os dados de lactase demonstram como ITC dados podem ser usados para estimar a esta…

Discussion

Uma grande vantagem do ensaio de estabilidade de enzima do ITC descrito aqui é automação. Uma vez que todos os buffers de adequadas e soluções são feitas, o tempo de set-up para cada ensaio é aproximadamente 15 min. para a pessoa que faz o ensaio. Em contraste, os ensaios convencionais para atividade de invertase e lactase requerem cerca de 2 h com envolvimento contínuo da pessoa fazendo o ensaio e muitos ensaios de atividade enzimática levar consideravelmente mais de homens-hora. Em uma publicação anterior, d…

Materials

a-Lactose	Fisher Scientific	unknown (too old)	500g
Sodium Acetate, Anhydrous 99% min	Alfa Aesar	A13184-30	250g
Lactase	MP Bio	100780	5g
Hydrocholric Acid Solution, 1N	Fisher Scientific	SA48-500	500mL
Benchtop Meter- pH	VWR	89231-622
Ethanol 70%	Fisher Scientific	BP8231GAL	1gallon
Micro-90	Fisher Scientific	NC024628	1L (cleaning solution)