等温滴定熱量測定による酵素の安定性を測定
Summary
酵素の熱安定性は、等温滴定型熱量計 (ITC) によって容易に測定されます。ほとんどの蛋白質の安定性の試金は現在メジャー タンパク質の変性を使用、酵素活性についての情報を提供しません。ITC は、酵素活性の安定性に関する酵素の変更の効果の直接測定できます。
Abstract
この作品は、等温滴定熱量測定 (ITC) による酵素活性の安定性を測定するための新しいメソッドを示します。酵素活性と相関している酵素液に基板の解決の単回投与後の観察のピーク熱速度。時間をかけて同じ酵素溶液に基板の複数の注射は、酵素活性の損失を示します。アッセイ、自律、非常に少しの担当者の時間を必要とするほとんどのメディアおよび酵素に適用されます。
Introduction
酵素は、蛋白質多彩な有機反応を触媒することができます。過酷な溶剤の使用を避けるため中性付近の水溶液でほとんど酵素機能。選択性が高く、酵素触媒反応生成少ない (いくつかのケースでは、副産物) 酸および塩基の1のような非選択性触媒よりも副産物。これは最終製品が人間の消費のために安全であるのですべての化学反応を行う必要がある食品の製造に特に関連します。現在、酵素は、高果糖コーン シロップ2チーズ3ビール4牛乳の乳糖無料5、およびその他の重要な食品の製造に使用されます。本稿では、食品産業における酵素利用、緑の化学、医薬品合成などの酵素のための他の多くの用途があります。
酵素の有用性は、酵素の立体構造を維持するのに依存する酵素活性の安定性によって制限されます。酵素の構造は、peg 修飾操作6、しっかりサポート7、遺伝の修正の8、および製剤の固定化などの変更により安定化することができます。現在、示差走査熱量測定 (DSC) で酵素の安定性通常計測、エンドポイント酵素試金9。DSC 測定温度で酵素が繰り広げられます。温度が高いほど安定した構造。ただし、活動の損失は多くの場合酵素または酵素10内のドメインを展開するために必要なよりも低い温度で発生します。したがって、DSC は酵素修飾酵素活性の安定性が向上するかどうかを判断するのに十分ではありません。エンドポイント酵素試金は通常集中の時間、複数のサンプルを必要とする、高い色または不透明なソリューションまたは懸濁液には適用されません結合比色反応も多い。
この作品は、等温滴定熱量測定 (ITC) による酵素活性の安定性の直接測定法を示します。ITC は、リリースや反応の中に吸収される熱の率を測定します。ほぼすべての反応生成熱を吸収するので、ミルクなど不透明なメディアの結合反応を持っていないか、発生する反応を含む、ほとんどの酵素触媒反応の ITC を使用できます。ITC は、反応の多くの種類の化学動力学的パラメーターを計測する何十年も使用されていますが、ここで提示されたプロトコル ITC を使用して酵素触媒反応のピーク熱率の計測に着目し、酵素活性が直線状にあることを示して熱のピークの速度と相関した.ピーク熱率の ITC 測定主自律やほとんど人件費をセットアップし、分析が必要です。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明した ITC 酵素安定性分析の主な利点は自動化です。すべての適切なバッファーおよび解決が行われると、各測定のセットアップ時間はアッセイを行う人のため約 15 分です。対照的に、インベルターゼ、ラクターゼの活動の従来の試金はアッセイを行う人の継続的な関与と約 2 時間を必要とし、多くの酵素活性アッセイを取るかなり増えた。前の文書では、インベルターゼ活性<sup cl…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
どれも
Materials
| a-Lactose | Fisher Scientific | unknown (too old) | 500g |
| Sodium Acetate, Anhydrous 99% min | Alfa Aesar | A13184-30 | 250g |
| Lactase | MP Bio | 100780 | 5g |
| Hydrocholric Acid Solution, 1N | Fisher Scientific | SA48-500 | 500mL |
| Benchtop Meter- pH | VWR | 89231-622 | |
| Ethanol 70% | Fisher Scientific | BP8231GAL | 1gallon |
| Micro-90 | Fisher Scientific | NC024628 | 1L (cleaning solution) |
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