Mesurer la stabilité enzymatique par calorimétrie isotherme de Titration

Summary

La stabilité thermique de l’activité enzymatique est facilement mesurable par calorimétrie isotherme titration (ITC). Des essais de stabilité protéique plus actuellement utilisé mesure protéine déplier, mais ne fournissent pas d’informations sur l’activité enzymatique. ITC permet la détermination directe de l’effet des modifications des enzymes sur la stabilité de l’activité enzymatique.

Abstract

Ce travail démontre une nouvelle méthode pour mesurer la stabilité de l’activité enzymatique par calorimétrie isotherme titration (ITC). Le taux de chaleur maximale observé après qu’une seule injection de la solution de substrat dans une solution d’enzyme est corrélée avec l’activité enzymatique. Des injections multiples du substrat dans la même solution d’enzyme au fil du temps montrent la perte de l’activité enzymatique. Le dosage est autonome, nécessitant très peu de temps du personnel et s’applique à la plupart des médias et des enzymes.

Introduction

Les enzymes sont des protéines capables de catalyser un large éventail de réactions organiques. La plupart fonction d’enzymes en solution aqueuse à pH neutre évitant ainsi l’utilisation de solvants agressifs. En raison de leur haute sélectivité, réactions enzymatiques catalysée produisent moins (dans certains ne cas, aucun sous-produits) sous-produits que catalyseurs non sélectifs tels que les acides et les bases¹. Ceci est particulièrement important dans la fabrication d’aliments où toutes les réactions chimiques doivent se faire si le produit final est plus sûr pour la consommation humaine. Actuellement, les enzymes sont utilisés pour produire de sirop de maïs riche en fructose², fromage³,⁴de la bière, lait sans lactose⁵et autres produits alimentaires importants. Bien que cet article se concentre sur l’utilisation des enzymes dans l’industrie alimentaire, il y a beaucoup d’autres utilisations pour les enzymes notamment dans la synthèse verte de chimie et de la drogue.

L’utilité des enzymes est limitée par la stabilité de l’activité enzymatique, qui repose sur le maintien de la structure tridimensionnelle de l’enzyme. La structure de l’enzyme peut être stabilisée par des modifications telles que PEGylation⁶, immobilisation sur un support solide⁷, modifications génétiques⁸et formulations. Actuellement, stabilité de l’enzyme est généralement mesurée par analyse calorimétrique différentielle (DSC) et des analyses de l’activité enzymatique point de terminaison⁹. DSC à mesurer la température à laquelle une enzyme se déploie ; plus la température est élevée, les plus stable de la structure. Toutefois, la perte d’activité se produit souvent à une température plus basse que celle nécessaire pour déplier l’enzyme ou les domaines au sein de l’ enzyme¹⁰. Par conséquent, DSC ne suffit pas à déterminer si une modification de l’enzyme augmente la stabilité de l’activité enzymatique. Essais enzymatiques de point de terminaison sont généralement temps intensif, nécessitent plusieurs échantillons et impliquent souvent une réaction colorimétrique couplée qui n’est pas applicable aux solutions très colorées ou opaques ou de suspensions.

Ce travail démontre une méthode de mesure directe de la stabilité de l’activité enzymatique par calorimétrie isotherme titration (ITC). ITC mesure le taux de chaleur libérée ou absorbée au cours d’une réaction. Étant donné que presque toutes les réactions produisent ou absorbent la chaleur, ITC peut être utilisé pour la plupart des réactions catalysées par les enzymes, incluant des réactions qui ne pas avoir une réaction de couplage ou se produisent dans les milieux opaques tels que le lait. ITC a été utilisé pendant de nombreuses décennies pour mesurer des paramètres cinétiques chimiques pour de nombreux types de réactions, mais le protocole présenté ici se concentre sur l’utilisation de ITC pour mesurer le débit de chaleur du pic des réactions catalysées par les enzymes et démontre que l’activité enzymatique est linéairement en corrélation avec le débit de chaleur maximal. ITC mesures de taux de pic de chaleur sont le plus souvent autonomes et nécessitent très peu de temps personnel pour configurer et analyser.

Protocol

1. préparation des échantillons 1 000 mL de tampon d’acétate de sodium 0,1 M à pH 4,6 Mesurer 800 mL d’eau distillée dans un bécher de 1 000 mL gradué. Environ 8,2 g d’acétate de sodium anhydre et ajoutez-le dans le bécher. Placer le bécher sur une plaque de remuer, placer une tige de mélanger dans le bol, tournez sur la plaque de remuer et remuer jusqu’à dissolution complète. Lorsque l’acétate de sodium anhydre est complètement…

Representative Results

Les résultats représentatifs dans la Figure 1 et Figure 5 affichent des données de deux enzymes, la lactase et invertase. La lactase et invertase catalysent l’hydrolyse d’un disaccharide en deux monosaccharides, endothermique et exothermique, respectivement. Les deux réactions enzymatiques ont été exécutées à des concentrations qui empêchaient la saturation de l’enzyme. Les données de la lactase démontrent comment le…

Discussion

Un avantage majeur de l’ITC stabilité enzymatique décrite ici est automation. Une fois que toutes les zones tampons appropriées et les solutions sont apportées, le temps d’installation pour chaque dosage est environ 15 min pour la personne qui effectue l’essai. En revanche, les tests classiques pour l’activité de l’invertase et la lactase nécessitent environ 2 h avec la participation continue de la personne qui effectue l’essai et de nombreux tests d’activité enzymatique prennent beaucoup plus d’he…

Materials

a-Lactose	Fisher Scientific	unknown (too old)	500g
Sodium Acetate, Anhydrous 99% min	Alfa Aesar	A13184-30	250g
Lactase	MP Bio	100780	5g
Hydrocholric Acid Solution, 1N	Fisher Scientific	SA48-500	500mL
Benchtop Meter- pH	VWR	89231-622
Ethanol 70%	Fisher Scientific	BP8231GAL	1gallon
Micro-90	Fisher Scientific	NC024628	1L (cleaning solution)