Meten van enzymatische stabiliteit door isothermische titratie calorimetrie
Summary
De thermische stabiliteit van enzymactiviteit is gemakkelijk gemeten door isothermische titratie calorimetrie (ITC). Meeste proteïne stabiliteit testen momenteel gebruikt maatregel eiwit ontvouwen, maar geven geen informatie over enzymatische activiteit. ITC kan directe bepaling van het effect van wijzigingen van het enzym op de stabiliteit van de enzymactiviteit.
Abstract
Dit werk toont een nieuwe methode voor het meten van de stabiliteit van de enzymactiviteit door isothermische titratie calorimetrie (ITC). De piek warmteverbruik waargenomen na een enkele injectie van het substraat oplossing in een oplossing van het enzym is gecorreleerd met enzymactiviteit. Meerdere injecties van het substraat in dezelfde enzym oplossing na verloop van tijd weergeven het verlies van de enzymactiviteit De bepaling is autonoom, waarvoor weinig personeel tijd, en is van toepassing op de meeste media en enzymen.
Introduction
Enzymen zijn eiwitten staat een breed scala aan organische reacties te katalyseren. De meeste enzymen functie in waterige oplossing bij in de buurt van neutrale pH dus het vermijden van het gebruik van agressieve oplosmiddelen. Vanwege hun hoge selectiviteit, enzym-gekatalyseerde reacties produceren minder (in sommige gevallen geen bijproducten) bijproducten dan niet-selectieve katalysatoren zoals zuren en basen1. Dit is vooral relevant in de voedingsmiddelen verwerkende waar alle chemische reacties moeten gebeuren zodat het uiteindelijke product veilig voor menselijke consumptie is. Op dit moment worden enzymen gebruikt voor het produceren van hoge fructose corn siroop2, kaas3, bier4, lactose-vrij melk5en andere belangrijke voedingsmiddelen. Hoewel dit document richt zich op enzym gebruik in de voedingsindustrie, zijn er vele andere toepassingen voor enzymen waaronder in groene chemie en drug synthese.
Het nut van enzymen wordt beperkt door de stabiliteit van de enzymactiviteit, die afhangt van het behoud van de driedimensionale structuur van het enzym. De structuur van het enzym kan worden gestabiliseerd door wijzigingen zoals PEGylation6, immobilisatie op een stevige steun7, genetische modificaties8en formuleringen. Momenteel, enzym stabiliteit wordt meestal gemeten door differentiële scanning calorimetrie (DSC) en eindpunt enzymactiviteit testen9. DSC meet de temperatuur waarbij een enzym ontvouwt; Hoe hoger de temperatuur, hoe meer stabiele de structuur. Verlies van activiteit treedt echter vaak op bij een lagere temperatuur dan nodig te ontvouwen de enzym of domeinen binnen de enzym-10. DSC is daarom niet voldoende om te bepalen of een wijziging van het enzym de stabiliteit van de enzymactiviteit verhoogt. Eindpunt enzym testen zijn meestal tijd intensieve, vereisen meerdere monsters, en vaak een gekoppelde colorimetrische reactie die geldt niet voor zeer gekleurd of ondoorzichtig oplossingen of schorsingen te betrekken.
Dit werk wordt een methode voor rechtstreekse meting van de stabiliteit van de enzymactiviteit gedemonstreerd door isothermische titratie calorimetrie (ITC). ITC meet de snelheid hitte vrijgegeven of geabsorbeerd in de loop van een reactie. Aangezien bijna alle reacties produceren of warmte absorberen, kan ITC worden gebruikt voor de meeste enzym-gekatalyseerde reacties, met inbegrip van de reacties die niet over een gekoppelde reactie of optreden in ondoorzichtige media zoals melk. ITC is gebruikt voor vele decennia voor het meten van chemische kinetische parameters voor vele soorten reacties, maar het protocol hier gepresenteerd richt zich op het gebruik van ITC voor het meten van het warmteverbruik van de piek van enzym-gekatalyseerde reacties en toont aan dat de enzymactiviteit lineair is gecorreleerd met de pieksnelheid voor warmte. ITC metingen van piek warmte tarieven zijn meestal autonome en weinig personeel tijd nodig om te installeren en te analyseren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een groot voordeel van de ITC enzym stabiliteit test hier beschreven is automatisering. Zodra alle passende buffers en oplossingen zijn gemaakt, is de tijd van de set-up voor elke assay ongeveer 15 min. voor de persoon die de test doet. In tegenstelling, de conventionele testen voor invertase en lactase-activiteit vereisen ongeveer 2 h met voortdurende betrokkenheid van de persoon die de test doet en veel enzymatische activiteit testen nemen aanzienlijk meer manuren. In een eerdere publicatie, hebben wij aangetoond hoe g…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Geen
Materials
| a-Lactose | Fisher Scientific | unknown (too old) | 500g |
| Sodium Acetate, Anhydrous 99% min | Alfa Aesar | A13184-30 | 250g |
| Lactase | MP Bio | 100780 | 5g |
| Hydrocholric Acid Solution, 1N | Fisher Scientific | SA48-500 | 500mL |
| Benchtop Meter- pH | VWR | 89231-622 | |
| Ethanol 70% | Fisher Scientific | BP8231GAL | 1gallon |
| Micro-90 | Fisher Scientific | NC024628 | 1L (cleaning solution) |
Riferimenti
- Anastas, P., Eghbali, N. Green chemistry: principles and practice. Chemical Society Reviews. 39 (1), 301-312 (2010).
- Jin, L. Q., et al. Immobilization of Recombinant Glucose Isomerase for Efficient Production of High Fructose Corn Syrup. Applied Biochemistry Biotechnoiogy. 183 (1), 293-306 (2017).
- Budak, &. #. 3. 5. 0. ;. &. #. 2. 1. 4. ;., Koçak, C., Bron, P. A., de Vries, R. P. . Microbial Cultures and Enzymes Dairy Technology. , 182-203 (2018).
- van Donkelaar, L. H. G., Mostert, J., Zisopoulos, F. K., Boom, R. M., van der Goot, A. J. The use of enzymes for beer brewing: Thermodynamic comparison on resource use. Energy. 115, 519-527 (2016).
- Rodriguez-Colinas, B., Fernandez-Arrojo, L., Ballesteros, A. O., Plou, F. J. Galactooligosaccharides formation during enzymatic hydrolysis of lactose: Towards a prebiotic-enriched milk. Food Chemistry. 145, 388-394 (2014).
- Lawrence, P. B., Price, J. L. How PEGylation influences protein conformational stability. Current Opinions in Chemical Biology. 34, 88-94 (2016).
- Bernal, C., Rodriguez, K., Martinez, R. Integrating enzyme immobilization and protein engineering: An alternative path for the development of novel and improved industrial biocatalysts. Biotechnology Advances. 36 (5), 1470-1480 (2018).
- Rigoldi, F., Donini, S., Redaelli, A., Parisini, E., Gautieri, A. Review: Engineering of thermostable enzymes for industrial applications. Applied Bioengeneering. 2 (1), 011501 (2018).
- Johnson, C. M. Differential scanning calorimetry as a tool for protein folding and stability. Archives of Biochemistry and Biophysics. 531 (1), 100-109 (2013).
- Chen, N. G., Gregory, K., Sun, Y., Golovlev, V. Transient model of thermal deactivation of enzymes. Biochimica et biophysica acta. 1814 (10), 1318-1324 (2011).
- Mason, M., et al. Calorimetric Methods for Measuring Stability and Reusability of Membrane Immobilized Enzymes. Jounal of Food Science. , (2017).
- Leksmono, C. S., et al. Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab. Journal of visualized experiments : Journal of Visual Experiments. (138), e54377 (2018).
