Summary
Den nåværende protokollen beskriver en eksperimentell plattform for å vurdere effekten av mekaniske og biokjemiske signaler på kjemoterapeutiske responser av pasientavledede glioblastomceller i 3D-matrise-mimetiske kulturer ved hjelp av en skreddersydd UV-belysningsenhet som letter høygjennomstrømning fotocrosslinking av hydrogeler med justerbare mekaniske egenskaper.
Abstract
Cellematriseinteraksjoner formidler komplekse fysiologiske prosesser gjennom biokjemiske, mekaniske og geometriske signaler, som påvirker patologiske endringer og terapeutiske responser. Å ta høyde for matriseeffekter tidligere i legemiddelutviklingsrørledningen forventes å øke sannsynligheten for klinisk suksess for nye terapeutiske behandlinger. Biomaterialebaserte strategier som rekapitlerer spesifikke vevsmikromiljøet i 3D-cellekulturen eksisterer, men det har vært utfordrende å integrere disse med 2D-kulturmetodene som primært brukes til legemiddelscreening. Dermed beskriver protokollen her utviklingen av metoder for 3D-kultur innen miniatyriserte biomaterialer i et flerbrønnsplateformat for å lette integrasjonen med eksisterende legemiddelscreeningsrørledninger og konvensjonelle analyser for celle levedyktighet. Siden matrisefunksjonene som er kritiske for å bevare klinisk relevante fenotyper i dyrkede celler forventes å være svært vevs- og sykdomsspesifikke, vil kombinatorisk screening av matriseparametere være nødvendig for å identifisere passende forhold for spesifikke applikasjoner. Metodene beskrevet her bruker et miniatyrisert kulturformat for å vurdere kreftcelleresponser på ortogonal variasjon av matrisemekanikk og ligandpresentasjon. Spesielt demonstrerer denne studien bruken av denne plattformen for å undersøke effekten av matriseparametere på svarene fra pasientavledede glioblastomceller (GBM) til kjemoterapi.
Introduction
De forventede kostnadene ved å utvikle et nytt legemiddel har økt jevnt det siste tiåret, med over 1 milliard dollar i dagens anslag1. En del av denne utgiften er den høye sviktraten for legemidler som går inn i kliniske studier. Omtrent 12% av narkotikakandidatene får til slutt godkjenning fra USA (US) Food &Drug Administration (FDA) i 2019. Mange legemidler svikter i fase I på grunn av uforutsett toksisitet2, mens andre som består sikkerhetsforsøk kan mislykkes på grunn av mangel på effekt3. Denne utmattelsen på grunn av ikke-effekt kan delvis forklares med at kreftmodeller som brukes under legemiddelutvikling er notorisk ikke-prediktive for klinisk effekt4.
Funksjonelle forskjeller mellom in vitro- og in vivo-modeller kan tilskrives fjerning av kreftceller fra deres opprinnelige mikromiljø, inkludert ikke-tumorceller og den fysiske ECM 5,6. Vanligvis bruker forskningsgrupper kommersielt tilgjengelige kulturmatriser, for eksempel Matrigel (en proteinholdig kjellermembranmatrise avledet fra mus sarkomer) for å gi kultiverte tumorceller et 3D-matrisemikromiljø. Sammenlignet med 2D-kultur har 3D-kultur i membranmatrise forbedret den kliniske relevansen av in vitro-resultater 7,8. Imidlertid viser kulturbiomaterialer fra decellularisert vev, inkludert membranmatrisen, vanligvis batch-til-batch variasjon som kan kompromittere reproduserbarhet9. Videre kan matriser avledet fra svulster med forskjellig vevsopprinnelse fra de studerte ikke gi de riktige fysiologiske signalene10. Til slutt har kreft med høye grader av intratumoral heterogenitet mikromiljøegenskaper som varierer på en submikronstørrelsesskala, og som membranmatrisen ikke kan justeres for å rekapitulere11.
Glioblastom (GBM), en jevnt dødelig hjernesvulst med en median overlevelsestid på ca. 15 måneder, er en kreft som behandlingsutviklingen har vært spesielt vanskelig for 12,13. Den nåværende standarden for omsorg for GBM består av primær tumor reseksjon, etterfulgt av strålebehandling, og deretter kjemoterapi ved hjelp av temozolomid (TMZ)14. Likevel viser mer enn halvparten av kliniske GBM-svulster behandlingsresistens gjennom ulike mekanismer 15,16,17. Det er ekstremt vanskelig å forutsi effekten av et behandlingsregime for en enkelt pasient. Standard prekliniske modeller som brukes til å forutsi individuelle resultater består av pasientavledede tumorceller xenograftert ortopisk til immunkompromitterte mus. Mens pasientavledede xenografter kan rekapitulere mange aspekter av kliniske GBM-svulster og er verdifulle for prekliniske modeller18, er de iboende dyre, lave gjennomstrømning, tidkrevende og involverer etiske bekymringer19. Kulturer av pasientavledede celler, på 2D-plastoverflater eller som sfæroider, unngår for det meste disse problemene. Mens pasientavledede celler bevarer genetiske avvik, har deres kulturer i 2D eller som suspenderte sfæroider i stor grad vært dårlige representasjoner av pasientavledede xenografter hos gnagere og originale pasientsvulster20. Tidligere har vi, og andre, vist at GBM-celler dyrket i en 3D ECM som etterligner de mekaniske og biokjemiske egenskapene til hjernevev, kan bevare legemiddelresistensfenotyper 10,21,22,23.
Interaksjoner mellom hyaluronsyre (HA), en polysakkarid rikelig i hjernen ECM og overekspressert i GBM svulster, og dens CD44 reseptor modulere oppkjøpet av narkotikaresistens in vitro 21,24,25,26,27. For eksempel økte inkluderingen av HA i myke 3D-kulturer evnen til pasientavledede GBM-celler til å oppnå terapeutisk motstand. Denne mekano-ansvarligheten var avhengig av HA-binding til CD44-reseptorer på GBM-cellene21. I tillegg integrin binding til RGD-bærende peptider, innlemmet i 3D kultur matriser, forsterket CD44-mediert chemoresistance i en stivhet-avhengig måte21. Utover HA varierer uttrykket for flere ECM-proteiner, mange som inneholder RGD-regioner, mellom normal hjerne og GBM-svulster28. For eksempel rapporterte en studie at 28 forskjellige ECM-proteiner ble oppregulert i GBM-svulster29. Innenfor dette komplekse tumormatrisemikromiljøet integrerer kreftceller mekaniske og biokjemiske signaler for å gi en bestemt resistensfenotype, som avhenger av relativt små forskjeller (f.eks. mindre enn en størrelsesorden) i Youngs modulus eller tetthet av integrinbindende peptider 28,29,30.
Den nåværende protokollen karakteriserer hvordan tumorceller tolker unike kombinasjoner av matrisesignaler og identifiserer komplekse, pasientspesifikke matrisemikromiljøet som fremmer behandlingsresistens (figur 1A). En fotokjemisk metode for å generere miniatyriserte, nøyaktig innstilte matriser for 3D-kultur gir et stort, ortogonalt variabelt rom. Et spesialbygd utvalg av lysdioder, drevet av en mikrokontroller, ble innlemmet i photocrosslink hydrogeler i et 384-brønns plateformat for å øke automatisering og reproduserbarhet. Eksponeringsintensiteten var variert på tvers av brønner for å endre mikromekaniske egenskaper til resulterende hydrogeler, vurdert ved hjelp av atomkraftmikroskopi (AFM). Selv om dette manuskriptet ikke fokuserer på å konstruere selve belysningsrekken, leveres et kretsdiagram (figur 1B) og deleliste (materialliste) som hjelpemidler for enhetsgjengivelse.
Denne rapporten demonstrerer den raske generasjonen av en rekke GBM-celler dyrket i unike 3D-mikromiljø der Youngs modulus (fire nivåer over en enkelt størrelsesorden) og integrinbindende peptidinnhold (avledet fra fire forskjellige ECM-proteiner) var variert ortogonalt. Tilnærmingen ble deretter brukt til å undersøke de relative bidragene fra hydrogelmekanikk og ECM-spesifikt integrinsk engasjement om levedyktighet og spredning av pasientavledede GBM-celler når de får resistens mot temozolomid (TMZ) kjemoterapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Pasientavledede GBM-cellelinjer (GS122 og GS304) ble levert av professor David Nathanson (vår samarbeidspartner), som utviklet disse linjene under en protokoll godkjent av UCLA Institutional Review Board (IRB # 10-000655). Celler ble av identifisert slik at cellelinjene ikke kunne kobles tilbake til de enkelte pasientene.
1. Fremstilling av hydrogeloppløsning
- Forbered HEPES-bufret oppløsning ved å oppløse HEPES-pulver på 20 mM i Hanks balanserte saltoppløsning (HBSS). Juster pH til 7 etter full solvering.
- I den HEPES-bufrede løsningen oppløses tiolert HA (700 kDa nominell molekylvekt, se Materialtabell), utarbeidet etter forrige rapport31, slik at 6%-8% av karboksylsyrerester på hver glukuronsyre endres med en tiol, i en konsentrasjon på 10 mg / ml i bufferløsning.
MERK: Et gult hetteglass anbefales for å forhindre tioloksidasjon ved omgivelseslys.- Rør med en magnetisk røreplate (<1000 o/min) ved romtemperatur til den er helt oppløst, vanligvis rundt 45 min.
- Mens HA oppløses, kan du lage separate løsninger på (1) 100 mg/ml 8-arm-PEG-Norbornene (20 kDa), (2) 100 mg/ml 4-arm-PEG-Thiol (20 kDa), (3) 4 mM cystein eller cysteinholdig peptid (f.eks. GCGYGRGDSPG) og (4) 4 mg/ml LAP i mikrosenterrør (se Materialfortegnelse).
- Klargjør hver av disse fire løsningene i den HEPES-bufrede løsningen som ble utarbeidet i trinn 1.1. Virvel løsningene for å sikre full oppløsning av hvert reagens før du utfører trinn 4.
MERK: Hvis du tester flere forskjellige peptider, må hver inneholde en cystein eller annen kilde til tiol moiety for denne konjugeringskjemien. - Forbered løsninger (4 mM tilgjengelig tiol) av alle peptider som skal festes i en enkelt hydrogel på dette tidspunktet.
MERK: Peptidsekvenser og ECM-proteiner som de ble avledet fra og brukt i denne studien, er oppført i tabell 1. N-acetylcystein (se Materialtabell), som celler ikke binder seg til, kan erstattes med et bioaktivt, tiolholdig peptid for å titrate konsentrasjonen av et klebende peptid eller fungere som en negativ kontroll31.
- Klargjør hver av disse fire løsningene i den HEPES-bufrede løsningen som ble utarbeidet i trinn 1.1. Virvel løsningene for å sikre full oppløsning av hvert reagens før du utfører trinn 4.
- Bland de individuelle løsningene til HA, PEG-Norbornene, PEG-tiol og cystein/tiolholdige peptider (se Materialfortegnelse) for å oppnå de endelige konsentrasjonene for de endelige hydrogelmatrisene som er oppført i tabell 2. Rør (<1000 o/min) på en magnetisk røreplate i minst 30 minutter for å blande seg helt.
MERK: HA-løsninger håndteres svært viskøse og håndteres best ved hjelp av en positiv forskyvningspipette (se Materialfortegnelse). Hvis en positiv forskyvningspipette ikke er tilgjengelig, kan viskøse løsninger også dispenseres med en standard mikropipette ved å sakte pipettering ved hjelp av brede åpningspisser.
2. Belysning og fotocrosslinking av hydrogeler via en LED-rekke
FORSIKTIG: Bruk UV-vernebriller og dekk belysningsfeltet med UV-absorberende materiale.
MERK: LED-matrisen som er beskrevet i denne protokollen, består av seks sett med åtte lysdioder plassert i serie, som illustrert av det medfølgende kretsdiagrammet (figur 1A). Hvert sett med lysdioder kan drives uavhengig, noe som gir opptil seks forskjellige bestrålinger per kjøring. Tilleggsfil 1 inneholder skjermbilder som tilsvarer følgende anvisninger for ytterligere veiledning.
- Last ned filen Illumination Device.zip fra tilleggskodingsfilene. Denne katalogen inneholder følgende filer: Arduino.zip (Supplementary Coding File 1), Drivers.zip (Supplementary Coding File 2), GUI.zip (Supplementary Coding File 3) og Holder.zip (Supplementary Coding File 4).
MERK: 3D Skriv ut de øverste og nederste delene for å holde kretskortet på plass (se Tilleggskodingsfiler for mer informasjon). - Last ned og installer mikrokontrollerprogramvaren (se Materialliste).
- Last ned og installer GUI-programvaren (se Tabell over materialer). Se Tilleggsfil 1 for bruksanvisning for programvare.
- Åpne Behandling og installer controlIP5-biblioteket ved å klikke på Skisse > Importer bibliotek > Legg til bibliotek. Søk deretter etter controlIP5 i biblioteker og klikk på Installer. Utfør dette for aller første gang.
- Slå på belysningsenheten (se Materialfortegnelse) ved hjelp av 36 volts strømforsyning og koble den til en PC ved hjelp av en mikro-USB-kabel.
MERK: Noen enheter vil ikke installere drivere automatisk for forskjellige Arduino nano boards. Ett sett med drivere finnes i zip-filen for enheten. - Åpne filen Arduino.ino, som ligger i mappen Adruino.zip ved hjelp av Arduino IDE.
- Kompiler Arduino.ino-filen ved å klikke på Hakemerke-knappen . Last opp den kompilerte koden ved å klikke på Pil-knappen .
- Åpne filen GUI.pde, som ligger i mappen GUI.zip, ved hjelp av Behandling.
- Klikk på Kjør i behandlingsprogrammet for å starte det grafiske brukergrensesnittet for å kontrollere belysningsenheten.
- I det grafiske brukergrensesnittvinduet klikker du på Intensitet for kolonnen som inneholder hydrogelforløperløsning som skal krysskobles og legger inn ønsket intensitet. Klikk på Tid-boksen og skriv inn ønsket tid. For løsningen i tabell 2 vil dette være 15 s.
MERK: Sluttbrukerne må kalibrere digitale intensitetsverdier til bestråling ved hjelp av et radiometer. Eksempler på typiske intensiteter finnes i figur 2A. - Juster prøvene etter belysningsenheten (figur 2B) med annenhver LED i en enkelt kolonne med silikonformene (se Materialtabell) eller 384-brønnsplate. Klikk på Fullfør for å begynne belysningen. Gjenta denne prosessen etter behov for belysning av flere sklier eller andre brønner på en 384-brønnsplate.
MERK: Holderen er konstruert slik at 384-brønnsplaten sitter i flukt med det ene hjørnet av det indre kammeret under belysningen.- Etter belysning, når den er plassert i ett hjørne, flytt brønnplaten til neste hjørne og gjenta. For å belyse brønner på den andre halvdelen av platen, løft platen ut av holderen og roter 180°.
- Generer hydrogeler med varierende mekanikk for mekanisk karakterisering ved å følge trinnene nedenfor.
- Rengjør glasssklier og silikonformer med tape for å fjerne rusk. Fest silikonformene til glasssklie, trykk ned for å sikre en god forsegling, og fortreng eventuelle luftbobler.
- Pipette 80 μL hydrogelforløperløsning, som fremstilt i trinn 1.4, i hver silikonform på glasssklie.
- Plasser glassskuffen på belysningsenheten på linje med annenhver LED i en enkelt kolonne. Utsett hydrogelforløperne for UV-lys i 15 s, som beskrevet i trinn 2, for photocrosslink.
- Når belysningen har stoppet, hent lysbildene og løsne gelene fra formene ved å spore den indre omkretsen av formen med en fin spiss (10 μL pipettespiss, 30 G nål, etc.). Fjern silikonformer med pinsett/tang.
- Flytt krysskoblede hydrogeler inn i individuelle brønner på en 12-brønns plate ved å fukte en slikkepott og forsiktig skyve dem av glasssklie. Fyll hver brønn med 2 ml DPBS (se Materialtabell) før du tilsetter hydrogelen. Hov gelene i DPBS-oppløsning i minst 12 timer (vanligvis over natten) ved romtemperatur (for neste dags mekaniske karakterisering).
3. Målinger av atomkraftmikroskopi (AFM)
- Slå på atomkraftmikroskopet (AFM) i henhold til produsentens instruksjoner (se Materialfortegnelse). Denne protokollen gir korte instruksjoner for bruk av instrumentet og tilhørende programvare.
- Monter AFM-proben (se Materialliste).
MERK: For den nåværende studien ble en trekantet silisiumnitmidkantilever med en nominell vårkonstant på 0,01 N / m modifisert med en sfærisk 2,5 μm silisiumdioksidpartikkel. - Etter installasjon justerer du laseren til toppen av den trekantede sonden, og justerer deretter speil- og laseravbøyning for å maksimere signalsummen (vanligvis mellom 1,5-2,2 volt).
- Senk sonden ned i DPBS og vent i opptil 15 minutter for å oppnå termisk likevekt. Klikk på Kalibrering-knappen og velg Kontaktavhengig kalibrering. Klikk på Samle termisk tuning-knappen , og etter datainnsamlingen velger du toppen rundt 3 kHz for kalibrering.
MERK: En liten justering av speil- og laserdeflektorene kan være nødvendig etter nedsenking i en væske på grunn av brytningsindeksendringer. - Nærme seg overflaten av en Petri-tallerken (plast) ved å sette Approach Parameters til Constant Velocity, en målhøyde på 7,5 μm og en tilnærmingshastighet på 15 μm / s. Aktiver Baseline-måling per kjøring for approach slik at tilnærmingen kjører kontinuerlig og ikke stopper tidlig på grunn av drift i deflektoren.
- Ved tilnærming angir du anskaffelsesparametere for kraftkartlegging til 4 nN-behandlinger, 2 μm innrykksavstand, 1 μm/s hastighet og 0 s kontakttid. Trykk på Start-knappen for å begynne å samle en kraftkurve på plastoverflaten (f.eks. en brønnplate).
- Gå tilbake til kalibreringsvinduet og velg den delen av kraftkurven som tilsvarer kontakt og innrykk av plasten. Godta de beregnede følsomhets- og stivhetsverdiene for sonden for å fullføre kalibreringen.
- Etter kalibrering hever du AFM-sonden og plasserer hydrogelprøven for avhør. Tilnærm deg hydrogel ved å følge innstillingene i trinn 5.
MERK: Under tilnærmingsprosedyren mot hydrogeloverflaten kan enheten ved en feiltakelse utløse den tilnærmte tilstanden. Hvis du vil kontrollere den faktiske tilnærmingen, oppnår du en kraftkurve som i trinn 4.6. Gjenta fremgangsmåten for tilnærming hvis den resulterende kurven ikke viser kontakt og resulterende innrykk. - Når overflatetilnærmingen er vellykket, bytter du til krafttilordningsmodus og setter anskaffelsesparametere til et kart på 8 x 8 størrelse med 40 μm lengde per akse. Få kraftkart i ulike regioner for å vurdere ensartetheten av stivhetsmålinger.
- Tolke kraftkurver ved hjelp av programmet JPK SPM Databehandling gjennom en Hertz/Sneddon modelltilpasning (ligninger 1 og 2, se tabell 3 for definisjonen av alle variablene) med den sfæriske geometrien valgt 32,33,3 4.
Formel 132
Formel 232
- Tolke kraftkurver ved hjelp av programmet JPK SPM Databehandling gjennom en Hertz/Sneddon modelltilpasning (ligninger 1 og 2, se tabell 3 for definisjonen av alle variablene) med den sfæriske geometrien valgt 32,33,3 4.
Formel 132
Formel 232
4. Oppsett og legemiddelbehandling av 3D, matrise-innebygde kulturer
- Forbered ønskede celler som en enkelt celleløsning.
MERK: Ulike celletyper kan kreve forskjellige pasningsmetoder. En typisk protokoll for å passere en suspensjonskultur av GBM-sfæroider fra en T-75 kolbe er rapportert i referanse31. - Samle GBM sfæroider (omtrent 150 μm i diameter) fra en T-75 kolbe suspensjon kultur til en 15 ml konisk rør. Skyll kulturflasken med 5 ml DPBS for å fjerne eventuelle gjenværende celler og medier og legg dette volumet til det koniske røret.
- Sentrifuger det koniske røret som inneholder celler ved 200 x g i 5 minutter ved romtemperatur. Etter sentrifugering, fjern supernatanten med en 5 ml serologisk pipette, pass på at du ikke forstyrrer cellepelleten, og resuspend i 5 ml DPBS.
- Sentrifuge ved 200 x g i 5 min ved romtemperatur for å vaske celler. Aspirer supernatanten med en 5 ml serologisk pipette, pass på at du ikke forstyrrer cellepelleten, og deretter resuspend celler i 2 ml celledissosiasjonsreagens (se materialtabellen).
- Inkuber ved romtemperatur i 10-15 min. Tilsett 3 ml komplett medium (se Materialtabell) og forsiktig pipette 3-5 ganger for å bryte ned sfæroidene til en enkelt celleoppheng31.
- Sentrifuger encellet suspensjon ved 400 x g (encellede suspensjoner kan spunnes raskere for pelletsdannelse) i 5 minutter til pelletsceller ved romtemperatur. Aspirer supernatanten med en 5 ml serologisk pipette, pass på at du ikke forstyrrer cellepelleten. Resuspend celler i 1 ml komplett medium.
MERK: Hvis cellene forblir i klumper, i stedet for som enkeltceller i suspensjon, etter passivring, kan celler føres gjennom en 40 μm cellesil for å oppnå en enkelt celle suspensjon. - Fjern en del av cellene for telling ved hjelp av et hemocytometer. Fortynn denne delen todelt med trypan blå, som gjennomsyrer celler med kompromittert levedyktighet. Tell bare de levende, fargeløse cellene. Vanligvis gir et T-75 frø på 800.000 celler per kolbe 2-3 millioner celler etter en uke i kultur.
- Bestem antall celler som er nødvendige for innkapsling. Overfør et volum medier som inneholder det totale antallet celler som trengs i et sterilt 1,7 ml mikrosenterrør. Spinn ned ved 400 x g i 5 min ved romtemperatur.
MERK: For eksempel er det nødvendig med minst 2,5 millioner celler som er resuspendert i 1 ml gelvolum for å innkapsle celler ved 2,5 millioner celler /ml. Et gelvolum på 1 ml gjør det mulig for brukere å dispensere 100 geldråper, hvor hver geldråpe er på 10 μL volum. Forberedelse av et ekstra ~ 20% volum celler suspendert i hydrogeloppløsning anbefales å ta hensyn til tap under pipetteoverføring. Dermed ville man forberede 3 millioner celler og 1,2 ml hydrogelforløperløsning i dette eksemplet. En minimumstetthet på 500 tusen celler / ml anbefales. - Aspirer supernatanten med en mikropipette, pass på at du ikke forstyrrer cellepelleten. Resuspend cellepellet i hydrogelforløperløsningen, som tilberedt i trinn 1.4, blander godt ved å pipettere opp og ned med en 1000 μL mikropipette 4-5 ganger.
- Last cellene inn i en gjentatt pipettor (se Materialtabell) som er satt til å dispensere 10 μL. For å unngå bobler og ujevn dispensering, klargjør du den gjentatte pipetten ved å dispensere ytterligere 1-2 ganger i en avfallsbeholder.
- I hver brønn av en 384-brønns plate, dispenser 10 μL celler suspendert i hydrogeloppløsning fra den gjentatte pipettoren. Bruk LED-matrisen til å belyse hver brønn som inneholder celler (trinn 2) i 15 s med intensiteter (eksempel resulterer i at figur 2A brukte intensiteter på 1,14, 1,55, 2,15, 2,74 mW/cm2) for å oppnå de ønskede mekaniske egenskapene.
MERK: Det anbefales å starte med fem repliker per eksperimentell tilstand og skalere opp eller ned avhengig av ønsket gjennomstrømning og varians for endepunktanalysen. - Tilsett 40 μL komplette medier i hver brønn som inneholder cellene. Tilsett 50 μL DPBS til ikke-eksperimentelle, tørre brønner rundt gelene for å minimere tap på grunn av fordampning.
- For GBM-celler, tilsett 40 μL av det medieholdige legemidlet (f.eks. TMZ, se Materialtabell) for å oppnå den endelige ønskede konsentrasjonen (10 μM-100 μM i dimetylsulfoksid (DMSO) eller kjøretøy (DMSO), tilsvarende, fra 3 dager etter innkapsling.
5. CCK8 spredningsanalyse
- Tilsett 10 μL CCK8-reagens (se Materialtabell) i hver brønn som inneholder cellene.
MERK: Hvis du utfører denne analysen for første gang, må du inkludere negative kontrollbrønner som kun medier eller cellefri hydrogel i media. - Inkuber i 1-4 timer i henhold til produsentens instruksjoner.
MERK: Denne tiden kan variere som en funksjon av celletype og tetthet, og dermed må inkubasjonstider testes for hver applikasjon slik at absorbansverdier faller innenfor et lineært område, et krav om å bruke Øls lov35. - Les absorbanser ved 450 nm for alle brønner etter inkubasjon.
- Beregn gjennomsnittlig absorbans ved 450 nm oppnådd i trinn 3 for kjøretøyets tilstand for hver gruppe. Del hver legemiddelbehandlet brønn med gjennomsnittet av kjøretøykontrollen per gruppe.
- Beregn konfidensintervaller ved å generere bootstrap-fordelinger (N = 10 000) ved hjelp av persentilmetoden36.
MERK: Generelt kan man bruke 95% konfidensintervaller og tolke forhold hvis konfidensintervaller ikke krysser over 1 for å være betydelige og garantere videre undersøkelser. Å sette konfidensintervaller til 95% er kongruent med å angi en signifikansavskjæring på p = 0,05. For dataene som vises i resultatene, er det nytte i å skille forhold som enten fremmer eller hemmer matrisemediert legemiddelresistens, som krever en to-siders analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
AFM-målinger bekreftet nøyaktig kontroll av hydrogelmekanikk som en funksjon av UV-bestråling (mW/cm2) under fotokryssing ved hjelp av en spesialbygd, Arduino-kontrollert LED-matrise (figur 2A). Hydrogelformuleringen som brukes i denne protokollen finnes i tabell 2. Avstanden mellom lysdiodene på den medfølgende malen samsvarer med avstanden for annenhver brønn på en 384-brønnsplate, noe som muliggjør dannelse av geler inne i platen (figur 2B). AFM-avhør av mikron-skala regioner på overflatene av enkelthydrgeler viste at hydrogeler med mykere gjennomsnitt Youngs moduli også hadde mindre områder av moduli enn stivere hydrogeler (figur 2C-E).
Cellesåingstettheter som maksimerer levedyktigheten, bør bestemmes empirisk for hver celletype. Denne studien viser at 3D-kulturer av GS122-celler sådd ved tettheter på 2500 000 celler/ml viste vesentlig høyere viaevner når de ble vurdert etter 7 dager i kultur sammenlignet med de som ble sådd ved tettheter på 500 000 celler/ml (figur 3A). Videre ble GS122- og GS304-celler brukt som modeller for å dyrke pasientavledede GBM-celler for å undersøke avhengigheten av kjemoterapirespons på stivhet og biokjemisk sammensetning av matrisemikromiljøet (figur 3B-D). Celle levedyktighet ble vurdert gjennom CCK8-analysen etter behandling med TMZ i 4 dager, noe som førte til en total kulturtid på 7 dager ved å skalere OD450-måling ved en tilsvarende kjøretøykontroll og generere 95% konfidensintervaller ved bootstrapping (N = 10,000) med persentilmetoden36. Med disse fordelingene ble forhold der konfidensintervaller ikke overlappet med en verdi på 1 (stiplet linje) ansett som signifikante. Sammenlignet med mer brukte statistiske metoder som t-tester eller ANOVA, er estimering av konfidensintervaller, ved hjelp av bootstrapping for å estimere distribusjoner som vil være til stede for større utvalgsstørrelser, foretrukket for screeninganalyser hvis mål er å identifisere et mindre delsett av betingelser for videre undersøkelse. En ekstra fordel med denne metoden er at forhold med mindre spredning i konfidensintervall kan prioriteres fremfor andre forhold med en lignende gjennomsnittsverdi, men en høyere spredning i konfidensintervallet. Denne studien indikerte at GS122-celler fikk overlevelsesfordeler ved mikromiljøinteraksjoner (figur 3B). Denne overlevelsesfordelen var signifikant i forholdene 0,8, 1 og 4 kPa, men ikke i 8 kPa-tilstanden for GS122-celler. GS304-celler var ufølsomme for både stivhet og TMZ-behandling.
Effekten av den biokjemiske sammensetningen av matrisemikromiljøet ble deretter undersøkt ved å variere inkluderingen av ECM-avledede, integrinbindende peptider (tabell 1) kjent for å være oppregulert i GBM tumormikromiljøet ved to stivheter, 0,8 kPa og 8 kPa. Igjen fikk GS304-celler ingen signifikant overlevelsesfordel ved matriseinkludering og var ufølsomme for TMZ. GS122-celler viste imidlertid overlevelsesgevinster i 8 kPa-tilstanden da osteopontin-avledede peptider ble inkludert i matrisen, mens inkorporering av integrinbindende sialoprotein (IBSP)- eller tenascin-C-avledede peptider ga minimale overlevelsesfordeler, for eksempel kultur i matriser med det generelle RGD-peptidet (figur 3C). Til sammenligning ga ingen peptider overlevelsesgevinster i 0,8 kPa-kulturtilstanden (figur 3D). Sammen tyder resultatene på iboende forskjeller i både matrise- og legemiddelresponser mellom de to pasientavledede cellelinjene som evalueres.
3D-hydrogelkulturer kan visualiseres ved hjelp av standard lysmikroskopi for å vurdere hvordan cellemorfologi og invasiv atferd påvirkes av kulturforhold på en cellelinjeavhengig måte (figur 4). Både GS122- og GS304-celler spres når de dyrkes i myke eller stive hydrogelmatriser, inkludert RGD-inneholdende peptider (figur 4A). Mens peptider påvirket cellespredning, forutså ikke nødvendigvis en celles evne til å spre seg kulturens evne til å skaffe seg TMZ-motstand. For eksempel viser GS122-celler en lignende mangel på spredning i både 0,8 og 8 kPa med osteopontin; GS122 viste imidlertid bare forbedret motstand mot TMZ i 8 kPa-tilstanden (figur 4B). Til slutt kan denne miniatyriserte 3D-kulturplattformen brukes til å dyrke menneskelige celler fra andre tumortyper, inkludert levedyktige organoider av terminalt differensierte, nevroendokrine prostatakreftceller (figur 4C).
Figur 1: Tegneserie skildring av protokollen. (A) Tegneserie skildring av prosessen for 3D kultur generasjon og overvåking. (1) HA-baserte hydrogelløsninger utarbeides. (2) Hydrogel-løsninger krysskobles deretter med variabel intensitet gjennom lysdioder kontrollert av en Arduino mikrokontroller. (3) Resulterende hydrogelmekanikk vurderes av AFM for å verifisere forskjellen i gelmekanikk. (4) Løsninger som samsvarer med formuleringen fra trinn 1, brukes deretter til å innkapsle pasientavledede GBM-celler og behandles med stoffet. (5) Etter 7 dager leses celle levedyktighet ut via CCK8 kolorimetrisk analyse. (B) Kretsdiagram for tilpasset LED-belysningsmatrise som brukes i denne protokollen. De enkelte komponentene er oppført i materiallisten. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Hydrogeler fremstilt med varierende stivhet ved hjelp av justerbare lysdioder for å modifisere bestråling. (A) Fiolinplott viser den beregnede Young's Modulus fra kraftkurver generert av AFM over tre overflateområder, som spenner over 40 μm x 40 μm, av individuelle hydrogeler. Youngs modulus av hver hydrogel vises som en funksjon av UV-bestråling under fotocrosslinking. Vannrette hvite linjer angir medianen for hver eksperimentelle gruppe. (B) LED-rekke med avstand som samsvarer med tonehøyden på flerbrønnsplater (384 brønner). (C) Varmekart som viser den regionale varianten av Youngs modulus (gjennomsnitt = 0,8 kPa) for en typisk gel krysskoblet ved eksponering for 1,55 mW/cm2 i 15 s. (D) Varmekart som viser den regionale variasjonen av Youngs modulus (gjennomsnitt = 8 kPa) for en typisk gel krysskoblet ved eksponering for 2,74 mW/cm2 i 15 s. (E) Histogram som illustrerer rekkevidden av Youngs modulusmålinger på tvers av overflaten av hydrogeler vist i C og D. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Ortogonal presentasjon av stivhet og integrinbindende peptid avslører iboende biologiske forskjeller mellom GBM-cellelinjer. (A) Typiske absorbansverdier for GS122-celler innkapslet i en 10 μL hydrogel med en tetthet på 500 000 eller 2500 000 celler per ml. (B) Legemiddelresponsdata for cellelinjene GS122 og GS304 visualiseres ved å normalisere OD450-verdien av de legemiddelbehandlede brønnene (N = 5) med gjennomsnittet av de kjøretøybehandlede brønnene (N = 5). Levedyktighet i forbindelse med legemiddelbehandling ble observert å variere ikke-lineært for hydrogelstivhet, noe som viste variasjon mellom cellelinjer. (C,D) Legemiddelresponsdata for cellelinjene GS122 og GS304 da typen integrinbindende peptid ble inkludert og matrisestivheten varierte ortogonalt. Alle feilfelt representerer konfidensintervallene på 95 % som oppnås ved bootstrapping av hver betingelse av N = 10 000. Den stiplede linjen (y-akse = 1) tilsvarer tilfellet der OD450 for behandlingsforholdene tilsvarer kjøretøyet. Alle eksperimentelle verdier ble oppnådd etter 7 dager i kulturen; TMZ ble tilsatt 3 dager etter første innkapsling for legemiddelstudier. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Morfologiske forskjeller mellom celler innkapslet i ulike HA-baserte hydrogelmiljøer. (A) Fasekontrastbilder av GS122 og GS304, når de dyrkes i en hydrogel (0,8 og 8 kPa), viste et RGD-motiv. Hvite piler angir celler med oppslagsmorfologier. (B) Fasebilder av GS122 og GS304, når de dyrkes i en hydrogel (0,8 og 8kPa), viste et peptid avledet fra osteopontin. Hvite piler angir celler med oppslagsmorfologier. Svarte piler angir celler med avrundede morfologier. Etter 7 dager i kultur ble bilder tatt, og TMZ ble lagt til 3 dager etter første innkapsling. (C) Fasebilde av et terminalt differensiert nevroendokrine prostataorganoid. Skalastenger = 200 μm (for A,B); 100 μm (for C). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Protein | Peptidsekvens |
| RGD | GCGYGRGDSPG |
| Tenascin-C | GCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIRGV |
| Integrin-bindende sialoprotein (IBSP) | GCGYGGGGNGEPRGDTYRAY |
| Osteopontin | GCGYGTVDVPDGRGDSLAYG |
Tabell 1: ECM-proteiner og avledede peptidsekvenser.
| Reagent | Innledende konsentrasjon | Volum (μL) | Endelig konsentrasjon |
| HA-SH-løsning | 10 mg/ml | 2300 | 5 mg/ml |
| PEG-SH | 100 mg/ml | 503 | Varierer per eksperiment |
| PEG-Norbornene | 100 mg/ml | 443 | Varierer per eksperiment |
| Peptid | 4 μM | 288 | 0,250 μM |
| Runde | 4 mg/ml | 288 | 0,25 mg/ml |
| HEPES-HBSS | N/a | 798 |
Tabell 2: Typiske sluttformuleringskomponenter for hydrogel.
| Variabel | Parameter |
| F | Kraft |
| E | Unges modulus |
| ν | Poissons forhold |
| δ | Innrykk (loddrett spissplassering) |
| en | Radius for kontaktsirkel |
| RS | Sfærens radius |
Tabell 3: Variabler og tilsvarende parametere for AFM-beregninger.
Tilleggsfil 1: Veiledning om bruk av LED-rekken for belysning og fotocrosslinking av hydrogeler. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggskodingsfil 1: Arduino-fil for LED-arraymikrokontroller (Arduino.zip). Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggskodingsfil 2: Tredjepartsdrivere for Arduino nano (drivere.zip). Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggskodingsfil 3: Behandlingsfil for GUI-kontroll av LED-arraymikrokontroller (GUI.zip). Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggskodingsfil 4: Fil for ekstern 3D-utskrift for LED-arraymikrokontroller (holder.zip). Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det nåværende arbeidet presenterer metoder for å generere 3D, miniatyriserte kulturer innen HA-basert samtidig som matrisestivhet og peptider er tilgjengelige for integrinsk engasjement. Denne teknikken muliggjør systematisk studie av hvordan matriseparametere påvirker cellulære fenotyper (f.eks. levedyktigheten til kreftceller utsatt for kjemoterapi) med økt gjennomstrømning. Tidligere tilnærminger, inkludert det som presenteres heri, har justert hydrogelstivheten ved å variere prosentandelen totalpolymer i den endelige formuleringen, der stivere hydrogeler har et høyere polymerinnhold21,31. Denne tilnærmingen krever imidlertid å forberede en unik hydrogelformulering for hver stivhet som ønskes, en prosess som iboende senker gjennomstrømningen. Her justeres hydrogelstivhet av varierende UV-bestråling under krysskobling, slik at hydrogeler med flere stivheter kan fås fra en enkelt forløperløsning. Fremtidige utøvere som kanskje ikke har mulighet til å konstruere den tilpassede belysningen som er beskrevet her, kan enkelt erstatte en kommersielt tilgjengelig UV-spotherdende enhet og justere belysningen ettersom forskjellige sektorer av en brønnplate er herdet. Ulempen med å bruke en kommersiell spotherdende enhet er redusert gjennomstrømning sammenlignet med den tilpassede belysningen. En begrensning av dagens metoder er at unike løsninger fortsatt må utarbeides for hver peptidtilstand. Lignende metoder har tidligere blitt brukt av andre grupper for å produsere stivhetsgradientholdige hydrogeler37,38. Denne studien viser imidlertid hvordan fotocrosslinking kan muliggjøre miniatyrisering av eksperimentelle prøver og redusere kompleksiteten i eksperimentelle oppsett. Samlet sett vil disse forbedringene tillate forskere å øke eksperimentell gjennomstrømning når de utfører 3D-kulturer i matrise-mimetiske biomaterialer og har nytte på tvers av flere felt innen biomedisinsk vitenskap utover nevro-onkologi.
De representative resultatene viser hvordan denne teknikken kan brukes til å sette opp miniatyriserte, 3D-kulturer av pasientavledede GBM-celler i definerte matriser, der tilgjengelige integrinbindende peptider og stivheter er varierte, innenfor en standard 384-brønnsplate som passer for flere standardanalyser. Denne metoden presenterer representative resultater for å screene hvordan matriseparametere påvirker responsen på TMZ-kjemoterapi i GBM-celler avledet fra to unike pasienter, betegnet som GS122- og GS304-celler. Av de to pasientavledede cellelinjene som ble evaluert her, var responsen fra GS122-celler til TMZ-behandling følsom for matrisemikromiljøet, mens GS304-cellenes respons var ufølsom. Når det gjelder matrisestivhet, dyrket GS122-celler i 3D-hydrogeler med en 4 kPa mikrokompressiv modulus maksimert TMZ-resistens, under hvilken tilstand behandlede celler økte i antall mer enn ubehandlede celler over et 7-dagers eksperimentelt kurs. Mekaniske egenskaper hadde større effekt på TMZ-resistens enn de integrinbindende peptidene som er inkludert. Dermed forventes det at effekten av varierende peptidkonsentrasjoner alene og i kombinasjon vil muliggjøre oppdagelsen av matriseforhold som fremmer narkotikaresistens i fremtiden. Ufølsomheten til GS304-celler til deres omkringliggende matrise kan indikere at matrisen er mer innflytelsesrik på celler, som GS122-celler, som opprinnelig er følsomme for TMZ, men får motstand under behandling. I motsetning til dette er i hvilken grad matriseindikatorer påvirker celler som allerede er behandlingsresistente i begynnelsen av eksperimentet uklart, som med GS304-celler.
Resultatene fra denne studien avviket noe fra tidligere rapporterte resultater. De mykeste HA-baserte hydrogelene evaluert (1 kPa bulk Youngs modulus, etterligner stivheten i innfødt hjerne) fremmet maksimal TMZ-resistens GBM-celler avledet fra fire svulster fra forskjellige pasienter enn det som ble evaluert her21. Det er flere mulige årsaker til dette avviket. For det første ble et utvidet utvalg av hydrogelstivheter forhørt i den nåværende studien, som sammenlignet hydrogeler over et område på 0,8 kPa til 8 kPa mikrokompressive moduli, mens tidligere studier sammenlignet bare hydrogeler med 1 kPa og 2 kPa Youngs moduli. I tillegg, i de tidligere studiene, ble mekanisk karakterisering gjort i bulkskala ved hjelp av lineær mekanisk kompresjon for å estimere Youngs modulus, mens AFM i denne studien ble brukt til å måle en mikrokompressiv modulus. For forskere som ønsker å implementere metodene som finnes her som ikke krever mikroskala mekanikkmålinger, er bulkskalamoduli, ved hjelp av reometri eller lineær mekanisk testing, helt akseptable erstatninger for AFM. Spesielt viste mikromekaniske analyser den heterogene modulen over overflaten av en enkelt gel. Sammenlignbare AFM-målinger på hydrogelene formulert i tidligere studier er ikke gjort, men det forventes at variansen av stivheter presentert i en enkelt hydrogel har vært større enn i den nåværende studien. Hydrogeler i de tidligere studiene ble generert ved hjelp av en Michael-type addisjonskryssing avhengig av kinetisk blanding ved 37 grader C 10,21,24. I motsetning tillater fotocrosslinking grundig blanding av hydrogelforløpere før lyseksponering, noe som forbedrer homogeniteten i 3D-hydrogelen og i sin tur reduserer variasjonen av celleresponser. Til slutt viser GBM-svulster notorisk heterogen og uforutsigbar oppførsel39, og det er derfor rimelig å forvente at celler avledet fra individuelle svulster også vil ha unike egenskaper. Denne mangelen på konsistens på tvers av pasientprøver motiverer behovet for en plattform med høy gjennomstrømning for å belyse pasientspesifikke tumoregenskaper.
Vanlige fallgruver når du utfører den miniatyriserte hydrogelfotocrosslinking-prosedyren inkluderer ufullstendig blanding av hydrogelforløpere, noe som resulterer i dårlig reproduserbarhet og spontan gelering av HA-løsningen mens du blander. Disse problemene kan reduseres ved å røre HA-tiol i minst 45 minutter og den komplette forløperløsningen i minst ytterligere 30 minutter mens du følger nøye med på pH av hydrogelforløperløsninger for å sikre at den forblir under 7 for å forhindre tioloksidasjon og dannelse av disulfid til krysskoblinger. I motsetning til krysskoblingsmetoder ved hjelp av en kinetisk Michael-type addisjonsmekanisme10,21, reduserer fotocrosslinking-metoden som brukes i denne protokollen sannsynligheten for spontan gelering når alle reagenser kombineres21. Kvalitetskontrollpunkter anbefales på det sterkeste, for eksempel måling av HA-tiolasjonsprosent31 og ekstra hydrogeler for parallell mekanisk testing til hver batch av 3D-kulturer. Til slutt må såingstetthet for 3D-innkapsling i hydrogeler identifiseres for hver celletype eller linje som brukes. Generelt viser resultatene at en minimumskonsentrasjon på 1 million celler/ml er tilstrekkelig for 3D-kulturen i de fleste celler, som danner sfæroider, inkludert pasientavledede GBM-celler, humane embryonale stamceller (H9) og menneskeskapte pluripotente stamceller (data ikke vist). Inkludering av ROCK-hemmerbehandling før innkapsling (trinn 4.1) ved bruk av spesielt sensitive celler anbefales også40.
I forbindelse med utvikling av nye behandlingsmetoder for GBM, gir protokollen som presenteres her metoder for funksjonelt screening av legemiddelresponser av pasientavledede GBM-celler i et fysiologisk relevant mikromiljø. Et rikt oppbevaringssted for genetiske, epigenetiske og kliniske mRNA-uttrykksdata for GBM (og andre kreftformer) er offentlig tilgjengelig takket være innsatsen til The Cancer Genome Atlas (TCGA) og andre15. Brukt i forbindelse med disse store datasettene, forventes det at data generert fra funksjonelle skjermer av miniatyriserte, 3D-kulturer kan avsløre nye korrelasjoner, noe som forbedrer prediksjonen av kliniske resultater hos individuelle pasienter. For eksempel kan subpopulasjoner av pasientsvulster identifiseres som noen behandling, som matriseforstyrrende forbindelser som cilengitide, kan forbedre kliniske resultater41. I tillegg til legemiddelrespons muliggjør denne kulturplattformen vurderinger av tumorcelleinvasjon ved hjelp av godt platekompatible, høyinnholdsbilder. Fleksibiliteten til denne plattformen til å innlemme mange forskjellige peptider, alene eller i kombinasjon, mens ortogonalt varierende stivheter kan bidra til å identifisere matrisefunksjoner som driver GBM tumor aggresjon.
Utover GBM kan disse metodene tilpasses for å undersøke effekten av matriseparametere på andre celletyper i sammenheng med andre sykdommer, vevsutvikling og normal vevsfunksjon. I fremtiden vil det være enkelt å øke gjennomstrømningen av disse metodene ytterligere, da de er spesielt designet for å utføres i sammenheng med flerbrønnplater for å lette adopsjon i eksisterende arbeidsflyter for narkotikaoppdagelse ved å bruke kommersielt tilgjengelige automatiserte væskebehandlere og høyinnholdsbilder. Facile-integrasjon med eksisterende infrastruktur og økt automatisering, som reduserer de tekniske ferdighetene som kreves for å produsere og vedlikeholde celleladede, 3D-hydrogelkulturer, vil redusere barrierene for å ta i bruk denne metoden betydelig. Mens arbeidet her spesifikt presenterer kulturer innen HA-baserte hydrogeler, forventes det at denne metoden enkelt kan oversettes til andre ofte brukte fotocrosslinkable materialer for 3D-cellekultur, for eksempel metakrylatert gelatin, og at metodene som rapporteres her vil gi en nyttig retningslinje for flere applikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å spesifikt anerkjenne Carolyn Kim, Amelia Lao, Ryan Stoutamore og Itay Solomon for deres bidrag til tidligere iterasjoner av fotogelasjonsordningen. Cellelinjene GS122 og GS304 ble sjenerøst levert av David Nathanson. Alle tallene ble opprettet med BioRender.com. UCLA kjernefasiliteter, Molecular Screening Shared Resources og Nano and Pico Characterization Laboratory var medvirkende til arbeidet. Chen Chia-Chun ble støttet av UCLA Eli og Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research Training Program. Grigor Varuzhanyan ble støttet av tumorcellebiologiopplæringsprogram NIH Grant (T32 CA 009056).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.1 kOhm resistors, 6 W | Digikey | 35601k1ft | |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Genesse Scientific | 21-108 | |
| 15 mL conical tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 365 nm LED | Digikey | ltpl-c034uvh365 | |
| 384 well plate | Bio Greiner One | 781090 | |
| 40 µm cell strainer | MTC bio | C4040 | |
| 4-Armed thiol terminated polyethlene glycol (20 kDa) | Laysan Bio | 4arm-PEG-SH-20K-1g | |
| 6 NPN BJTs | Digikey | 2n5550ta | |
| 80 Ohm resistors, 0.125 W | Digikey | erjj-6enf80r6v | |
| 8-Armed norbornene terminated polyethylene glycol (20 kDa) | Jenkem Technology | A7025-1 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104500 | cell dissociation reagent |
| AFM Probes | Novascan | 0.01 N/m Nominal spring constant, 2.5 µm SiO2 particle | |
| Arduino IDE | Arduino | 1.8.19 | |
| Arduino Nano | Makerfire | Mini Nano V3.0 ATmega328P Microcontroller Board | |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | 20 ng/mL |
| CCK8 | Abcam | ab228554 | |
| Centrifuge | Thermoscientific | sorvall legend xtr | |
| CP100ST | Gilson | F148415 | Pipette tips for positive displacement pipette |
| Cubis Semi-Micro Balance | Sartorius | MSA225S100DI | |
| DMEM - F12 (50-50) | Life Technologies | 11330057 | 1x |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| DPBS Ca (-) Mg (-) | Genesse Scientific | 25-508 | |
| EGF | Peprotech | AF100-15 | 50 ng/mL |
| Ethanol, Anhydrous | Fisher Scientific | A405P | Add DI water to dilute to 70% |
| Fisherbrand Class B Amber Glass threaded vials | Fisher Scientific | 03-339-23C | |
| Fisherbrand Weighing Paper | Fisher Scientific | 09-898-12B | |
| G21 Supplement | Gemini Bio | 400-160 | 50x |
| Hanks Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | 14175095 | |
| HCl, ACS, 12M | Sigma Aldrich | S25838A | Add DI water to dilute to 1 M |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma Aldrich | H3149-100Ku | 25 µg/mL |
| HEPES | Sigma Aldrich | H7006-100G | |
| Hot Air Gun | Wagner | HT1000 | |
| Integrin-binding sialoprotein (IBSP) peptide | Genscript | Custom Order | GCGYGGGGNGEPRGDTYRAY |
| Lithium phenyl-2,4,6 trimethylbenzoylphosphinate (LAP) , >95% | Sigma Aldrich | 900889-1G | |
| Magnetic stir plate | Thermo Scientific | SP194715 | |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | Sorvall legend micro 21R | |
| Microman E single Channel Pipettor | Gilson | FD10004 | Positive displacement pipette |
| Micropipette Tips | Various Manufacturs | Various sizes | |
| mLine micropipette | Sartorious | ||
| N-acetyl Cysteine | Sigma Aldrich | A7250-10G | |
| Nanowizard 4 | Bruker | AFM microscope | |
| NaOH | Fisher Scientific | ss255-1 | Add DI water to dilute to 1 M |
| Normoicin | Invivogen | ant-nr-1 | 500x |
| Osteopontin Peptide | Genscript | Custom Order | GCGYGTVDVPDGRGDSLAYG |
| Pipet Aid | Drummond | 4000102 | |
| Plain Microscope Slides | Globe Scientific | 1301 | |
| Press-To-Seal silicone Isolator, 12-4.5mm diam x 2mm deep | Grace Bio Labs | 664201-A | Cut so that 8 individual molds are made from a single sheet |
| Processing | Processing | 3.5.4 | |
| Repeater M4 | Eppendorf | 4982000322 | |
| Repeater Pipette Tips | Sartorious | 30089430 | 1 mL sizes |
| RGD Peptide | Genscript | GCGYGRGDSPG | |
| Scoth Tape | |||
| Serological Pipettes | Genesse Scientific | 12-102,12-104 | 5,10 mL Pipettes |
| Solder Paste | Digikey | 315-NC191LT15T5-ND | |
| Solder Wire | |||
| Straight dissecting forceps | VWR Scientific | 82027-408 | |
| Synergy H1 Plate Reader | Biotek | ||
| T-75 Cell Culture Treated Flask | Genesee Scientific | 25-209 | |
| Temozolomide | Sigma Aldrich | T2577 | Typically used from 10 µM to 100 µM |
| Tenascin-C Peptide | Genscript | GCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIR GV |
|
| Thiolated Hyaluronic Acid (700 kDa), 6-8% modified | Lifecore Biomedical | HA700K5 | |
| VWR Spinbar, Flea Micro | VWR | 58948-375 |
References
- Scannell, J. W., Blanckley, A., Boldon, H., Warrington, B. Diagnosing the decline in pharmaceutical R&D efficiency. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (3), 191-200 (2012).
- Waring, M. J., et al. An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).
- Khozin, S., Liu, K., Jarow, J. P., Pazdur, R. Why do oncology drugs fail to gain US regulatory approval. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 450-451 (2015).
- Booth, B., Ma, P., Glassman, R.
- Da Ros, M., et al. Glioblastoma chemoresistance: The double play by microenvironment and blood-brain barrier. International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 2879 (2018).
- Broekman, M. L., et al.
- Grundy, T. J., et al. Differential response of patient-derived primary glioblastoma cells to environmental stiffness. Scientific Reports. 6 (1), 1-10 (2016).
- Gomez-Roman, N., Stevenson, K., Gilmour, L., Hamilton, G., Chalmers, A. J. A novel 3D human glioblastoma cell culture system for modeling drug and radiation responses. Neuro-Oncology. 19 (2), 229-241 (2017).
- Simoni, R. D., et al. Basement membrane complexes with biological activity. Biochemistry. 25 (2), 312-318 (2002).
- Xiao, W., et al. Brain-mimetic 3D culture platforms allow investigation of cooperative effects of extracellular matrix features on therapeutic resistance in glioblastoma. Cancer Research. 78 (5), 1358-1370 (2018).
- Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L.
- Spinelli, C., et al. Molecular subtypes and differentiation programmes of glioma stem cells as determinants of extracellular vesicle profiles and endothelial cell-stimulating activities. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1490144 (2018).
- Ostrom, Q. T., Cioffi, G., Waite, K., Kruchko, C., Barnholtz-Sloan, J. S. CBTRUS statistical report: Primary brain and other central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2014-2018. Neuro-Oncology. 23, Supplement_3 (2021).
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
- Brennan, C. W., et al. The somatic genomic landscape of glioblastoma. Cell. 155 (2), 462-477 (2013).
- Tomczak, K., Czerwińska, P., Wiznerowicz, M. The Cancer Genome Atlas (TCGA): An immeasurable source of knowledge. Contemporary oncology. 19, Poznan, Poland. 68-77 (2015).
- Lee, S. Y.
- Joo, K. M., et al. Patient-specific orthotopic glioblastoma xenograft models recapitulate the histopathology and biology of human glioblastomas in situ. Cell Reports. 3 (1), 260-273 (2013).
- Levy, N. The use of animal as models: Ethical considerations. International Journal of Stroke. 7 (5), 440-442 (2012).
- Phon, B. W. S., Kamarudin, M. N. A., Bhuvanendran, S., Radhakrishnan, A. K. Transitioning preclinical glioblastoma models to clinical settings with biomarkers identified in 3D cell-based models: A systematic scoping review. Biomedicine & Pharmacotherapy. 145, 112396 (2022).
- Xiao, W., et al. Bioengineered scaffolds for 3D culture demonstrate extracellular matrix-mediated mechanisms of chemotherapy resistance in glioblastoma. Matrix Biology. 85-86, 128-146 (2020).
- Brancato, V., Oliveira, J. M., Correlo, V. M., Reis, R. L., Kundu, S. C. Could 3D models of cancer enhance drug screening. Biomaterials. 232, 119744 (2020).
- Xu, X., Farach-Carson, M. C., Jia, X. Three-dimensional in vitro tumor models for cancer research and drug evaluation. Biotechnology Advances. 32 (7), 1256-1268 (2014).
- Xiao, W., Ehsanipour, A., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Hyaluronic-acid based hydrogels for 3-dimensional culture of patient-derived Glioblastoma Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e58176 (2018).
- Preston, M. Digestion products of the PH20 hyaluronidase inhibit remyelination. Annals of Neurology. 73 (2), 266-280 (2013).
- Kim, Y., Kumar, S. CD44-mediated adhesion to hyaluronic acid contributes to mechanosensing and invasive motility. Molecular Cancer Research. 12 (10), 1416-1429 (2014).
- Pibuel, M. A., Poodts, D., Díaz, M., Hajos, S. E., Lompardía, S. L. The scrambled story between hyaluronan and glioblastoma. The Journal of Biological Chemistry. 296, 100549 (2021).
- Xiao, W., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Integrating the glioblastoma microenvironment into engineered experimental models. Future Science OA. 3 (3), (2017).
- Trombetta-Lima, M., et al. Extracellular matrix proteome remodeling in human glioblastoma and medulloblastoma. Journal of Proteome Research. 20 (10), 4693-4707 (2021).
- Schregel, K., et al. Characterization of glioblastoma in an orthotopic mouse model with magnetic resonance elastography. NMR in Biomedicine. 31 (10), 3840 (2018).
- Xiao, W., Ehsanipour, A., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Hyaluronic-acid based hydrogels for 3-dimensional culture of patient-derived glioblastoma cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e58176 (2018).
- Guz, N., Dokukin, M., Kalaparthi, V., Sokolov, I. If cell mechanics can be described by elastic modulus: Study of different models and probes used in indentation experiments. Biophysical Journal. 107 (3), 564-575 (2014).
- Sneddon, I. N. The relation between load and penetration in the axisymmetric boussinesq problem for a punch of arbitrary profile. International Journal of Engineering Science. 3 (1), 47-57 (1965).
- Soofi, S. S., Last, J. A., Liliensiek, S. J., Nealey, P. F., Murphy, C. J. The elastic modulus of MatrigelTM as determined by atomic force microscopy. Journal of Structural Biology. 167 (3), 216-219 (2009).
- Mayerhöfer, T. G., Popp, J. Beer's law - Why absorbance depends (almost) linearly on concentration. Chemphyschem: A European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 20 (4), 511-515 (2019).
- Puth, M. T., Neuhäuser, M., Ruxton, G. D. On the variety of methods for calculating confidence intervals by bootstrapping. Journal of Animal Ecology. 84 (4), 892-897 (2015).
- Lavrentieva, A.
- Zhu, D., Trinh, P., Li, J., Grant, G. A., Yang, F. Gradient hydrogels for screening stiffness effects on patient-derived glioblastoma xenograft cellfates in 3D. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 109 (6), 1027-1035 (2021).
- da Hora, C. C., Schweiger, M. W., Wurdinger, T., Tannous, B. A. Patient-derived glioma models: From patients to dish to animals. Cells. 8 (10), 1177 (2019).
- Li, W., et al. Characterization and transplantation of enteric neural crest cells from human induced pluripotent stem cells. Molecular Psychiatry. 23 (3), 499-508 (2018).
- Scaringi, C., Minniti, G., Caporello, P., Enrici, R. M. Integrin inhibitor cilengitide for the treatment of glioblastoma: A brief overview of current clinical results. Anticancer Research. 32 (10), 4213-4224 (2012).
