الزرد الجامع جبل الرفيع قرار مزدوج نيون في الموقع التهجين
Summary
جبل بأكمله في الموقع التهجين هي واحدة من أكثر التقنيات المستخدمة على نطاق واسع في البيولوجيا التطورية. هنا ، نقدم قرار عالية الفلورسنت مزدوجة في البروتوكول الموقع التهجين لتحليل نمط التعبير الدقيق لجين واحد وتحديد مجالات التداخل في التعبير عن اثنين من الجينات. نحن تتضمن يوديد النووية propidium مكافحة وصمة عار لتسليط الضوء على تنظيم الأنسجة.
Abstract
جبل بأكمله<em> في الموقع</em> التهجين هي واحدة من أكثر التقنيات المستخدمة على نطاق واسع في البيولوجيا التطورية. هنا ، فإننا نقدم عالية الدقة المزدوجة الفلورسنت<em> في الموقع</em> بروتوكول التهجين لتحليل نمط التعبير الدقيق لجين واحد وتحديد مجالات التداخل في التعبير عن اثنين من الجينات. البروتوكول هو نسخة معدلة من معيار<em> في الموقع</em> التهجين باستخدام الفوسفاتيز القلوية وركائز مثل NBT / BCIP الأحمر وسريع<sup> 1،2</sup>. هذا البروتوكول يستخدم معيار digoxygenin فلوريسئين وصفت تحقيقات مع تضخيم إشارة tyramide (TSA)<sup> 3</sup>. المتاحة تجاريا مجموعات TSA تسمح يمكن استخدام التصميم التجريبي مرنة ومضان الانبعاثات من الاخضر الى الاحمر وحتى في تركيبة مع البقع النووية المختلفة ، مثل يوديد propidium ، أو المناعية لبروتينات مضان. TSA تنتج ركيزة التفاعل الفلورسنت التي تساهميا بسرعة بربط الأنصاف ، وبقايا التيروسين عادة ، في المناطق الملاصقة للriboprobe العقاقير المسماة. ويمكن ملاحظة أنماط تلطيخ الناتجة ارتفاع القرار في ذلك توطين التحت خلوية مرنا للاستخدام ليزر متحد البؤر المجهر<sup> 3،4</sup>. يمكن للمرء أن يلاحظ المحاضر الوليدة في مواضع الكروموسومات ، تميز تلطيخ النووية وحشوية ووضع تصور لأنماط أخرى مثل توطين القشرية من مرنا. دراسات في<em> ذبابة الفاكهة</em> تشير إلى أن حوالي 70 ٪ من mRNAs المعرض أنماط محددة من التوطين التحت خلوية التي ترتبط في كثير من الأحيان مع وظيفة هذا البروتين المشفرة<sup> 5</sup>. عندما يقترن بمساعدة الكمبيوتر تعمير مجموعات البيانات مبائر 3D ، لدينا بروتوكول يسمح للتحليل مفصل لتوزيع مرنا مع شبه الخلوية القرار في أجنة الفقاريات كلها.
Protocol
Discussion
بروتوكول المعروضة هنا يعمل بشكل جيد مع التحقيقات التي تعطي إشارة قوية نظيفة بعد تلطيخ عن 30-45 دقيقة في الفوسفاتاز القلوية ، توسطت فيه رد فعل نموذجي. قبل تنفيذ بروتوكول فلوري التهجين في الموقع ، ونحن لدينا دائما اختبار تحقيقات باستخدام معيار غير الفلورسنت البروتوكول (?…
Acknowledgements
نود أن نعترف إسهامات جوليتش Dörthe ، الجولة جنيفر وأندرو مارا في تطوير هذا البروتوكول. دعم البحوث المقدمة من معاهد الصحة القومية ، والجمعية الأميركية للسرطان ، ومارس من الدايمات.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Paraformaldehyde 16% solution, EM Grade | Electron Microscopy Services | 15710 | Dilute to 4% in 1.33x PBS (final 1x). Store in 2ml aliquots at –20°C | |
| Proteinase K, recombinant PCR grade | Roche | 03115879001 | Make a 20mg/ml stock solution in water. Store in 1ml aliquots at –20°C | |
| Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | Make a 10% stock solution in 1x maleic acid buffer. Store in 50ml aliquots at –20°C. Stable over multiple freeze/thaws. | |
| Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments | Roche | 11426346910 | Aliquot and store at -20°C. Keep one working aliquot at 4°C. | |
| Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments | Roche | 11207739910 | As above. | |
| TSA Plus Fluorescein system | Perkin Elmer | NEL741001KT | Prepare each vial of TSA reagent only when needed. Dissolve in 60μl DMSO. Store at 4°C. | |
| TSA Plus Cyanine5 system | Perkin Elmer | NEL745001KT | As above | |
| TSA Plus Cyanine3 system | Perkin Elmer | NEL744001KT | As above | |
| TSA Kit #16 AlexaFluor647 tyramide (plus HRP-goat-anti-rabbit IgG) | Molecular Probes /Invitrogen | T20926 | Dissolve tyramide reagent in 150μl DMSO, aliquot and store at –20°C. | |
| RNase, DNase free | Roche | 11119915001 | Supplied as 500μg/ml solution | |
| Propidium Iodide | Molecular Probes /Invitrogen | P-3566 | Supplied as 1mg/ml solution in water. |
References
- Schulte-Merker, S., Ho, R. K., Herrmann, B. G., Nüsslein-Volhard, C. The protein product of the zebrafish homologue of the mouse T-gene is expressed in nuclie of the germ ring and the notochord of the early embryo. Development. 116, 1021-1027 (1992).
- Jowett, T. Double in situ hybridization techniques in zebrafish. Methods. 23, 345-358 (2001).
- Jülich, D. beamter/deltaC and the role of Notch ligands in the zebrafish somite segmentation, hindbrain neurogenesis and hypochord differentiation. Dev Biol. 286, 391-404 (2005).
- Mara, A., Schroeder, J., Chalouni, C., Holley, S. A. Priming, Initiation and Synchronization of the Segmentation Clock by deltaD and deltaC. Nat Cell Biol. 9, 523-530 (2007).
- Lecuyer, E. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
