הר שלמים הכלאה באתרו היא אחת הטכניקות הנפוצה ביותר בביולוגיה התפתחותית. כאן, אנו מציגים ברזולוציה גבוהה פלורסנט כפול פרוטוקול הכלאה באתרו לניתוח דפוס הביטוי המדויק של גן יחיד לקביעת חפיפה של תחומים הביטוי של שני גנים. אנו כוללים propidium גרעיני יודיד נגד כתם להדגיש ארגון רקמות.
Abstract
שלמה הר<em> באתרו</emהכלאה> היא אחת הטכניקות הנפוצה ביותר בביולוגיה התפתחותית. כאן, אנו מציגים ברזולוציה גבוהה כפול פלורסנט<em> באתרו</em> הכלאה פרוטוקול לניתוח דפוס הביטוי המדויק של גן יחיד לקביעת חפיפה של תחומים הביטוי של שני גנים. הפרוטוקול הוא גירסה שונה של תקן<em> באתרו</em> הכלאה באמצעות phosphatase אלקליין מצעים כגון NBT / BCIP ומהירה האדום<sup> 1,2</sup>. פרוטוקול זה מנצל תקן digoxygenin והעמסת בדיקות שכותרתו יחד עם הגברה אות tyramide (TSA)<sup> 3</sup>. ערכות זמינים מסחרית TSA לאפשר עיצוב ניסיוני גמישה כמו פליטת הקרינה מירוק עד אדום ניתן להשתמש בשילוב עם כתמים גרעיני שונים, כגון יודיד propidium, או אימונוהיסטוכימיה הקרינה של חלבונים. TSA מייצרת המצע פלורסנט תגובתי כי במהירות קוולנטית נקשר moieties, שאריות טירוזין בדרך כלל, בסביבה הקרובה של riboprobe antisense שכותרתו. דפוסי מכתים וכתוצאה מכך הם ברזולוציה גבוהה בלוקליזציה כי subcellular-mRNA ניתן לצפות באמצעות לייזר מיקרוסקופיית confocal<sup> 3,4</sup>. אפשר לצפות תמלילי המתהווה על לוקוסים כרומוזומליות, להבדיל מכתים גרעיני cytoplasmic ולדמיין דפוסים אחרים כגון בלוקליזציה קליפת המוח של mRNA. מחקרים<em> תסיסנית</em> עולה כי כ 70% mRNAs התערוכה דפוסים ספציפיים של לוקליזציה subcellular כי לעתים קרובות לתאם עם הפונקציה של החלבון המקודד<sup> 5</sup>. בשילוב עם שחזור בעזרת מחשב של מערכי נתונים confocal 3D, פרוטוקול שלנו מאפשרת ניתוח מפורט של חלוקת mRNA עם רזולוציה משנה הסלולר עוברי החולייתנים כולה.
Protocol
1. קיבעון תקן עוברים לילה ב 4 ° C עם paraformaldehyde 4% (PFA) ב-PBS. הסר לתקן ולשטוף 2 x PBS, 5 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר (RT). עוברים dechorionate ידני PBS בצלחת זכוכית דיכאון באמצעות מלקחיים…
Discussion
הפרוטוקול המובא כאן עובד היטב עם בדיקות שנותנות איתות חזק נקי לאחר מכתים עבור 30-45 דקות phosphatase בתיווך אלקליין טיפוסי התגובה. לפני ביצוע פלורסנט בפרוטוקול הכלאה באתרו, אנחנו תמיד לבדוק בדיקות שלנו באמצעות פרוטוקול סטנדרטי שאינו ניאון (בתנאי בחומר משלים יחד עם פרוטוקול…
Acknowledgements
ברצוננו להכיר את תרומתם של Dörthe Jülich, ג'ניפר עגול ואנדרו מארה בפיתוח פרוטוקול זה. מחקר תמיכה הניתנים על ידי NICHD, האגודה האמריקנית למלחמה בסרטן ואת מצעד הפרוטות.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Paraformaldehyde 16% solution, EM Grade
Electron Microscopy Services
15710
Dilute to 4% in 1.33x PBS (final 1x). Store in 2ml aliquots at –20°C
Proteinase K, recombinant PCR grade
Roche
03115879001
Make a 20mg/ml stock solution in water. Store in 1ml aliquots at –20°C
Blocking Reagent
Roche
11096176001
Make a 10% stock solution in 1x maleic acid buffer. Store in 50ml aliquots at –20°C. Stable over multiple freeze/thaws.
Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments
Roche
11426346910
Aliquot and store at -20°C. Keep one working aliquot at 4°C.
Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments
Roche
11207739910
As above.
TSA Plus Fluorescein system
Perkin Elmer
NEL741001KT
Prepare each vial of TSA reagent only when needed. Dissolve in 60μl DMSO. Store at 4°C.
Brend, T., Holley, S. A. Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (25), e1229, doi:10.3791/1229 (2009).