Zebrafish intero monte ad alta risoluzione doppia fluorescente In Situ Ibridazione

Summary

Montare tutto ibridazione in situ è ​​una delle tecniche più utilizzate in biologia dello sviluppo. Qui, presentiamo una ad alta risoluzione doppio fluorescente in protocollo ibridazione in situ per analizzare il modello preciso espressione di un singolo gene e per determinare la sovrapposizione dei domini di espressione di due geni. Includiamo un propidio ioduro nucleare contro-macchia per evidenziare l'organizzazione dei tessuti.

Abstract

Intero monte<em> In situ</emIbridazione> è una delle tecniche più utilizzate in biologia dello sviluppo. Qui, presentiamo una ad alta risoluzione doppio fluorescente<em> In situ</em> Protocollo di ibridazione per analizzare il modello preciso espressione di un singolo gene e per determinare la sovrapposizione dei domini di espressione di due geni. Il protocollo è una versione modificata dello standard<em> In situ</em> Ibridazione con fosfatasi alcalina e substrati come NBT / BCIP e Fast Red^1,2. Questo protocollo utilizza standard di sonde digossigenina e marcato con fluoresceina amplificazione del segnale tyramide (TSA)³. I kit disponibili in commercio permettono TSA flessibili di progettazione sperimentale emissione di fluorescenza da verde a rosso-lontano può essere utilizzato in combinazione con diverse macchie di nucleare, come lo ioduro di propidio, o immunoistochimica fluorescenza per le proteine. TSA produce un substrato reattivo fluorescente che rapidamente si lega covalentemente alla combinazione di sostanze, residui di tirosina di solito, nelle immediate vicinanze del riboprobe antisenso etichettati. Il risultante pattern di colorazione sono ad alta risoluzione in quella localizzazione subcellulare del mRNA può essere osservato con microscopio confocale a scansione laser^3,4. Si può osservare trascrizioni nascente presso i loci cromosomici, distinguere colorazione nucleare e citoplasmatica e visualizzare altri modelli come ad esempio la localizzazione corticale di mRNA. Studi in<em> Drosophila</em> Indicano che circa il 70% di mRNA presentano modelli specifici di localizzazione subcellulare che spesso in correlazione con la funzione della proteina codificata⁵. Quando combinato con il computer-aided ricostruzione di set di dati 3D confocale, il nostro protocollo permette l'analisi dettagliata della distribuzione mRNA con risoluzione sub-cellulare negli embrioni dei vertebrati tutto.

Protocol

1. FISSAGGIO Fissare gli embrioni notte a 4 ° C con il 4% paraformaldeide (PFA) in PBS. Rimuovere e lavare fissare 2 x PBS, 5 minuti ciascuno a temperatura ambiente (RT). Embrioni manualmente dechorionate in PBS in un piatto depressione vetro con pinze orologiaio. Dopo dechorionation, gli embrioni vengono trasferiti utilizzando un incendio lucidato vetro pipetta Pasteur in quanto possono attenersi a pipette polipropilene. Trasferimento di embrioni attraverso una serie di 25%, 50…

Discussion

Il protocollo presentato qui funziona bene con le sonde che danno un forte segnale pulito dopo la colorazione per 30-45 minuti in una fosfatasi alcalina-mediata tipica reazione. Prima di eseguire il protocollo di ibridazione fluorescente in situ, abbiamo sempre testare le nostre sonde utilizzando lo standard non fluorescente protocollo (fornito in materiale supplementare con il protocollo di sintesi sonda). Abbiamo avuto meno successo con il protocollo di ibridazione fluorescente in situ utilizzando sonde più debole, m…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Paraformaldehyde 16% solution, EM Grade		Electron Microscopy Services	15710	Dilute to 4% in 1.33x PBS (final 1x). Store in 2ml aliquots at –20°C
Proteinase K, recombinant PCR grade		Roche	03115879001	Make a 20mg/ml stock solution in water. Store in 1ml aliquots at –20°C
Blocking Reagent		Roche	11096176001	Make a 10% stock solution in 1x maleic acid buffer. Store in 50ml aliquots at –20°C. Stable over multiple freeze/thaws.
Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments		Roche	11426346910	Aliquot and store at -20°C. Keep one working aliquot at 4°C.
Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments		Roche	11207739910	As above.
TSA Plus Fluorescein system		Perkin Elmer	NEL741001KT	Prepare each vial of TSA reagent only when needed. Dissolve in 60μl DMSO. Store at 4°C.
TSA Plus Cyanine5 system		Perkin Elmer	NEL745001KT	As above
TSA Plus Cyanine3 system		Perkin Elmer	NEL744001KT	As above
TSA Kit #16 AlexaFluor647 tyramide (plus HRP-goat-anti-rabbit IgG)		Molecular Probes /Invitrogen	T20926	Dissolve tyramide reagent in 150μl DMSO, aliquot and store at –20°C.
RNase, DNase free		Roche	11119915001	Supplied as 500μg/ml solution
Propidium Iodide		Molecular Probes /Invitrogen	P-3566	Supplied as 1mg/ml solution in water.