Zebrafish Whole Mount Alta Resolução Duplo Fluorescente In Situ Hibridização
Summary
Montar toda a hibridização in situ é uma das técnicas mais utilizadas em biologia do desenvolvimento. Aqui, apresentamos uma alta resolução de dupla fluorescentes em protocolo de hibridização in situ para analisar o padrão de expressão precisa de um único gene e para determinar a sobreposição dos domínios de expressão dos dois genes. Incluímos uma propidium iodeto nuclear contra-coloração para destacar a organização do tecido.
Abstract
Montar toda<em> In situ</emHibridização> é uma das técnicas mais utilizadas em biologia do desenvolvimento. Aqui, apresentamos uma alta resolução de dupla fluorescentes<em> In situ</em> Protocolo de hibridização para analisar o padrão de expressão precisa de um único gene e para determinar a sobreposição dos domínios de expressão dos dois genes. O protocolo é uma versão modificada do padrão<em> In situ</em> Hibridização com fosfatase alcalina e substratos tais como NBT / BCIP e Red Rápido<sup> 1,2</sup>. Este protocolo utiliza sondas padrão digoxigenina e fluoresceína rotulados junto com amplificação de sinal tiramida (TSA)<sup> 3</sup>. Os kits disponíveis comercialmente TSA permitem delineamento experimental flexível como emissão de fluorescência do verde ao vermelho-extremo pode ser usado em combinação com várias manchas nuclear, como o iodeto de propídio, ou imunohistoquímica de fluorescência para as proteínas. TSA produz um substrato reativo fluorescente que rapidamente covalentemente liga-se a metades, tipicamente resíduos de tirosina, nas imediações do riboprobe antisense rotulados. Os padrões de coloração resultantes são de alta resolução em que a localização subcelular do mRNA pode ser observado através de varredura a laser microscopia confocal<sup> 3,4</sup>. Pode-se observar transcrições nascente no loci cromossômicos, distinguir coloração nuclear e citoplasmática e visualizar outros padrões, como localização cortical de mRNA. Estudos em<em> Drosophila</em> Indicam que aproximadamente 70% dos mRNAs exibem padrões específicos de localização subcelular que freqüentemente se correlacionam com a função da proteína codificada<sup> 5</sup>. Quando combinado com computer-aided reconstrução de conjuntos de dados 3D confocal, o nosso protocolo permite a análise detalhada da distribuição de mRNA com sub-celular resolução em embriões vertebrados todo.
Protocol
Discussion
O protocolo apresentado aqui funciona bem com sondas que dar um sinal forte limpa após coloração por 30-45 minutos em uma fosfatase alcalina mediada típico de reação. Antes de realizar a fluorescente no protocolo de hibridização in situ, sempre testamos nossas sondas utilizando o protocolo não fluorescente padrão (desde que no material suplementar juntamente com o protocolo de síntese de sonda). Temos tido menos sucesso com as fluorescentes em protocolo de hibridização in situ utilizando sondas quando mais …
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer as contribuições de Dorthe Jülich, Round Jennifer e Mara Andrew no desenvolvimento deste protocolo. Apoio à pesquisa fornecido pelo NICHD, a Sociedade Americana do Câncer ea March of Dimes.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Paraformaldehyde 16% solution, EM Grade | Electron Microscopy Services | 15710 | Dilute to 4% in 1.33x PBS (final 1x). Store in 2ml aliquots at –20°C | |
| Proteinase K, recombinant PCR grade | Roche | 03115879001 | Make a 20mg/ml stock solution in water. Store in 1ml aliquots at –20°C | |
| Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | Make a 10% stock solution in 1x maleic acid buffer. Store in 50ml aliquots at –20°C. Stable over multiple freeze/thaws. | |
| Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments | Roche | 11426346910 | Aliquot and store at -20°C. Keep one working aliquot at 4°C. | |
| Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments | Roche | 11207739910 | As above. | |
| TSA Plus Fluorescein system | Perkin Elmer | NEL741001KT | Prepare each vial of TSA reagent only when needed. Dissolve in 60μl DMSO. Store at 4°C. | |
| TSA Plus Cyanine5 system | Perkin Elmer | NEL745001KT | As above | |
| TSA Plus Cyanine3 system | Perkin Elmer | NEL744001KT | As above | |
| TSA Kit #16 AlexaFluor647 tyramide (plus HRP-goat-anti-rabbit IgG) | Molecular Probes /Invitrogen | T20926 | Dissolve tyramide reagent in 150μl DMSO, aliquot and store at –20°C. | |
| RNase, DNase free | Roche | 11119915001 | Supplied as 500μg/ml solution | |
| Propidium Iodide | Molecular Probes /Invitrogen | P-3566 | Supplied as 1mg/ml solution in water. |
References
- Schulte-Merker, S., Ho, R. K., Herrmann, B. G., Nüsslein-Volhard, C. The protein product of the zebrafish homologue of the mouse T-gene is expressed in nuclie of the germ ring and the notochord of the early embryo. Development. 116, 1021-1027 (1992).
- Jowett, T. Double in situ hybridization techniques in zebrafish. Methods. 23, 345-358 (2001).
- Jülich, D. beamter/deltaC and the role of Notch ligands in the zebrafish somite segmentation, hindbrain neurogenesis and hypochord differentiation. Dev Biol. 286, 391-404 (2005).
- Mara, A., Schroeder, J., Chalouni, C., Holley, S. A. Priming, Initiation and Synchronization of the Segmentation Clock by deltaD and deltaC. Nat Cell Biol. 9, 523-530 (2007).
- Lecuyer, E. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
