ゼブラフィッシュの全マウント高分解能二重蛍光上皮内ハイブリダイゼーション
Summary
in situハイブリダイゼーション全体のマウントは、発生生物学で最も広く使用されている技術の一つです。ここで、我々は、単一の遺伝子の正確な発現パターンを解析するためと、二つの遺伝子の発現領域の重なりを判定するためのin situハイブリダイゼーションのプロトコールで二重蛍光の高解像度を示す。我々は、組織の組織を強調するためにカウンター染色核のヨウ化プロピジウムを含む。
Abstract
全体のマウント<em>その場で</em>ハイブリダイゼーションは、発生生物学で最も広く使用されている技術の一つです。ここで、我々は、高解像度の二重蛍光を示す<em>その場で</em単一の遺伝子の正確な発現パターンを解析するためのと二つの遺伝子の発現領域の重なりを判定するための>ハイブリダイゼーションプロトコル。プロトコルは、標準の修正バージョンです。<em>その場で</emこのようなNBT / BCIPやFast Redなどのアルカリホスファターゼと基板を使用して>ハイブリダイゼーション<sup> 1,2</sup>。このプロトコルは、チラミドシグナル増幅（TSA）と一緒に標準的なジゴキシゲニンおよびフルオレセイン標識プローブを利用<sup> 3</sup>。市販のTSAキットには、緑から遠赤色に蛍光発光のような柔軟な実験計画がこのようなヨウ化プロピジウム、またはタンパク質の蛍光免疫組織化学などの様々な核染色と組み合わせて使用することができることができます。 TSAは、迅速に共有結合標識アンチセンスリボプローブのすぐ近くに、部分、通常はチロシン残基に結合する反応性蛍光基質を生成します。結果として得られる染色パターンは、mRNAの細胞内局在性の高分解能であるレーザ走査共焦点顕微鏡を用いて観察することができます。<sup> 3,4</sup>。一つは、染色体の遺伝子座での新生転写物を観察し、核と細胞質染色を区別し、mRNAの皮質局在などの他のパターンを視覚化することができます。の研究<em>ショウジョウバエ</em> mRNAの約70％は頻繁にコードされたタンパク質の機能と相関する細胞内局在性の特定のパターンを示すことを示している<sup> 5</sup>。 3D共焦点データセットのコンピュータ支援復興と組み合わせると、我々のプロトコルは、全体の脊椎動物の胚では、サブ携帯の解像度を持つmRNAの分布を詳細に分析することができます。
Protocol
Discussion
ここで紹介するプロトコールは、典型的なアルカリホスファターゼを介した反応で30〜45分のために染色した後、クリーンな強力な信号を与えるプローブでうまく動作します。 in situハイブリダイゼーションのプロトコールで蛍光を実行する前に、我々は常に標準の非蛍光プロトコルを（プローブの合成プロトコルと共に補足資料で提供される）を使用して私たちのプローブをテストします。?…
Acknowledgements
我々は、このプロトコルの開発にDörtheユーリッヒ、ジェニファーラウンドとアンドリューマーラの貢献を感謝したい。 NICHD、米国癌学会とマーチオブダイムスが提供する研究支援。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Paraformaldehyde 16% solution, EM Grade | Electron Microscopy Services | 15710 | Dilute to 4% in 1.33x PBS (final 1x). Store in 2ml aliquots at –20°C | |
| Proteinase K, recombinant PCR grade | Roche | 03115879001 | Make a 20mg/ml stock solution in water. Store in 1ml aliquots at –20°C | |
| Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | Make a 10% stock solution in 1x maleic acid buffer. Store in 50ml aliquots at –20°C. Stable over multiple freeze/thaws. | |
| Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments | Roche | 11426346910 | Aliquot and store at -20°C. Keep one working aliquot at 4°C. | |
| Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments | Roche | 11207739910 | As above. | |
| TSA Plus Fluorescein system | Perkin Elmer | NEL741001KT | Prepare each vial of TSA reagent only when needed. Dissolve in 60μl DMSO. Store at 4°C. | |
| TSA Plus Cyanine5 system | Perkin Elmer | NEL745001KT | As above | |
| TSA Plus Cyanine3 system | Perkin Elmer | NEL744001KT | As above | |
| TSA Kit #16 AlexaFluor647 tyramide (plus HRP-goat-anti-rabbit IgG) | Molecular Probes /Invitrogen | T20926 | Dissolve tyramide reagent in 150μl DMSO, aliquot and store at –20°C. | |
| RNase, DNase free | Roche | 11119915001 | Supplied as 500μg/ml solution | |
| Propidium Iodide | Molecular Probes /Invitrogen | P-3566 | Supplied as 1mg/ml solution in water. |
References
- Schulte-Merker, S., Ho, R. K., Herrmann, B. G., Nüsslein-Volhard, C. The protein product of the zebrafish homologue of the mouse T-gene is expressed in nuclie of the germ ring and the notochord of the early embryo. Development. 116, 1021-1027 (1992).
- Jowett, T. Double in situ hybridization techniques in zebrafish. Methods. 23, 345-358 (2001).
- Jülich, D. beamter/deltaC and the role of Notch ligands in the zebrafish somite segmentation, hindbrain neurogenesis and hypochord differentiation. Dev Biol. 286, 391-404 (2005).
- Mara, A., Schroeder, J., Chalouni, C., Holley, S. A. Priming, Initiation and Synchronization of the Segmentation Clock by deltaD and deltaC. Nat Cell Biol. 9, 523-530 (2007).
- Lecuyer, E. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
