Zebra balığı Tüm Dağı Yüksek Çözünürlüklü Çift Floresan Yerinde Hibridizasyon
Summary
In situ hibridizasyon Tüm montaj, gelişim biyolojisi en yaygın olarak kullanılan teknikleri biridir. Burada, tek bir genin kesin ifadelerde desen analiz ve iki genin ifadesi etki çakışma belirlenmesi için çift floresan in situ hibridizasyon protokol yüksek çözünürlüklü sunuyoruz. Biz bir doku organizasyon vurgulamak için propidium iyodür nükleer karşı leke içerir.
Abstract
Tüm montaj<em> In situ</em> Hibridizasyon gelişim biyolojisi en yaygın olarak kullanılan teknikleri biridir. Burada, yüksek çözünürlüklü bir çift floresan mevcut<em> In situ</em> Hibridizasyon, tek bir genin kesin ifadelerde desen analiz ve iki gen ifadesi etki çakışma belirlenmesi için protokol. Protokol, standart modifiye edilmiş bir versiyonu<em> In situ</em> Hibridizasyon kullanarak alkalin fosfataz ve NBT / BCIP ve Hızlı Kırmızı gibi yüzeylerde<sup> 1,2</sup>. Bu protokol tyramide sinyal amplifikasyon (TSA) ile birlikte standart digoxygenin ve flöresein etiketli probları kullanır<sup> 3</sup>. Piyasada bulunan TSA kitleri uzak kırmızı yeşil floresan emisyon olarak esnek bir deneysel tasarım propidium iyodür veya proteinler için floresan immünohistokimya gibi çeşitli nükleer lekeleri ile birlikte kullanılabilir izin verir. TSA hızlı kovalent etiketli antisens Spastine Özgü Riboprop hemen yakınında, moieties genellikle tirozin kalıntılarının bağlanır reaktif bir floresan substrat üretir. Konfokal mikroskobi lazer tarama kullanarak boyanma mRNA bu hücre içi lokalizasyonu yüksek çözünürlükte görülebilir<sup> 3,4</sup>. Bir kromozom bölgeleri, doğmakta olan transkript gözlemlemek nükleer ve sitoplazmik boyanma ayırt ve mRNA kortikal lokalizasyon gibi diğer desen görselleştirmek. Yapılan çalışmalar<em> Drosophila</em> MRNA'ların kabaca% 70, sık sık kodlanmış proteinin fonksiyonu ile korelasyon Subselüler localisation özel kalıplara uyduğunu gösterir<sup> 5</sup>. 3D konfokal veri setleri, bilgisayar destekli bir yeniden yapılanma ile birlikte kullanıldığında, bütün omurgalı embriyolarının alt hücresel çözünürlük ile mRNA dağıtım protokolü detaylı analiz sağlar.
Protocol
Discussion
Burada sunulan protokol tipik bir alkalin fosfataz aracılı reaksiyon 30-45 dakika boyandıktan sonra temiz ve güçlü bir sinyal vermek problar ile iyi çalışır. Floresan in situ hibridizasyon protokolü performans öncesinde, her zaman bizim probları standart floresan olmayan protokolü (prob sentezi protokolü ile birlikte tamamlayıcı malzeme) kullanarak test edin. Zayıf problar kullanarak, floresan in situ hibridizasyon protokol az başarı oldu, ama bazı durumlarda mümkün olabilir. Β-katenin 3</su…
Acknowledgements
Biz bu protokolü geliştirme Dörthe Jülich, Jennifer Yuvarlak ve Andrew Mara katkılarını kabul etmek istiyorum. NICHD, Amerikan Kanser Derneği ve Dimes Mart tarafından sağlanan araştırma desteği.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Paraformaldehyde 16% solution, EM Grade | Electron Microscopy Services | 15710 | Dilute to 4% in 1.33x PBS (final 1x). Store in 2ml aliquots at –20°C | |
| Proteinase K, recombinant PCR grade | Roche | 03115879001 | Make a 20mg/ml stock solution in water. Store in 1ml aliquots at –20°C | |
| Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | Make a 10% stock solution in 1x maleic acid buffer. Store in 50ml aliquots at –20°C. Stable over multiple freeze/thaws. | |
| Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments | Roche | 11426346910 | Aliquot and store at -20°C. Keep one working aliquot at 4°C. | |
| Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments | Roche | 11207739910 | As above. | |
| TSA Plus Fluorescein system | Perkin Elmer | NEL741001KT | Prepare each vial of TSA reagent only when needed. Dissolve in 60μl DMSO. Store at 4°C. | |
| TSA Plus Cyanine5 system | Perkin Elmer | NEL745001KT | As above | |
| TSA Plus Cyanine3 system | Perkin Elmer | NEL744001KT | As above | |
| TSA Kit #16 AlexaFluor647 tyramide (plus HRP-goat-anti-rabbit IgG) | Molecular Probes /Invitrogen | T20926 | Dissolve tyramide reagent in 150μl DMSO, aliquot and store at –20°C. | |
| RNase, DNase free | Roche | 11119915001 | Supplied as 500μg/ml solution | |
| Propidium Iodide | Molecular Probes /Invitrogen | P-3566 | Supplied as 1mg/ml solution in water. |
References
- Schulte-Merker, S., Ho, R. K., Herrmann, B. G., Nüsslein-Volhard, C. The protein product of the zebrafish homologue of the mouse T-gene is expressed in nuclie of the germ ring and the notochord of the early embryo. Development. 116, 1021-1027 (1992).
- Jowett, T. Double in situ hybridization techniques in zebrafish. Methods. 23, 345-358 (2001).
- Jülich, D. beamter/deltaC and the role of Notch ligands in the zebrafish somite segmentation, hindbrain neurogenesis and hypochord differentiation. Dev Biol. 286, 391-404 (2005).
- Mara, A., Schroeder, J., Chalouni, C., Holley, S. A. Priming, Initiation and Synchronization of the Segmentation Clock by deltaD and deltaC. Nat Cell Biol. 9, 523-530 (2007).
- Lecuyer, E. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
