Zebrafish entier Mont haute résolution double fluorescent In Situ Hybridation

Summary

Monter toute l'hybridation in situ est l'une des techniques les plus utilisées en biologie du développement. Ici, nous présentons une haute résolution double fluorescentes dans le protocole de l'hybridation in situ pour analyser le profil d'expression précise d'un seul gène et de déterminer le chevauchement des domaines d'expression de deux gènes. Nous incluons une iodure de propidium nucléaires contre-coloration pour mettre en évidence l'organisation tissulaire.

Abstract

Whole montage<em> In situ</emL'hybridation> est l'une des techniques les plus utilisées en biologie du développement. Ici, nous présentons une haute résolution à double fluorescentes<em> In situ</emProtocole d'hybridation> pour analyser le profil d'expression précise d'un seul gène et de déterminer le chevauchement des domaines d'expression de deux gènes. Le protocole est une version modifiée de la norme<em> In situ</emL'hybridation> en utilisant la phosphatase alcaline et de substrats tels que NBT / BCIP et Fast-Rouge^1,2. Ce protocole utilise la norme sondes digoxygénine et marqué à la fluorescéine ainsi que l'amplification du signal tyramide (TSA)³. Les kits disponibles dans le commerce TSA permettent flexibles expérimentale de conception telle émission de fluorescence du vert au rouge lointain peut être utilisé en combinaison avec divers colorants nucléaires, comme l'iodure de propidium, ou immunohistochimie de fluorescence pour les protéines. TSA produit un substrat réactif fluorescent rapidement covalente lie à des fragments, des résidus de tyrosine généralement, dans le voisinage immédiat de la ribosonde antisens étiquetés. L'intensité de la coloration qui en résultent sont à haute résolution dans cette localisation subcellulaire des ARNm peut être observé en utilisant la microscopie confocale à balayage laser^3,4. On peut observer des transcriptions naissant au loci chromosomiques, de distinguer la coloration nucléaire et cytoplasmique et visualiser d'autres modèles tels que la localisation corticale de l'ARNm. Studies in<em> Drosophile</em> Indiquent qu'environ 70% des ARNm présentent des modèles spécifiques de localisation subcellulaire qui souvent en corrélation avec la fonction de la protéine codée⁵. Lorsqu'il est combiné avec assistée par ordinateur reconstruction des ensembles de données 3D confocale, notre protocole permet l'analyse détaillée de la distribution de l'ARNm avec des sub-cellulaire de la résolution embryons de vertébrés ensemble.

Protocol

1. FIXATION Fix embryons nuit à 4 ° C avec 4% de paraformaldéhyde (PFA) dans le PBS. Retirer fixage et de lavage 2 x PBS, 5 minutes chacun à la température ambiante (RT). Embryons manuellement dechorionate en PBS dans une plaque de verre de dépression en utilisant une pince horloger. Après dechorionation, les embryons sont transférés à l'aide d'un incendie poli pipette Pasteur en verre, car ils peuvent coller à Pipettes en polypropylène. Transfert des embryons…

Discussion

Le protocole présenté ici fonctionne bien avec des sondes qui donnent un signal propre forte après coloration pendant 30-45 minutes dans une phosphatase alcaline médiée typiques de réaction. Avant de procéder à l'fluorescente protocole d'hybridation in situ, nous examinons toujours nos sondes en utilisant la norme non fluorescent protocole (fourni dans le matériel supplémentaire avec le protocole de synthèse de la sonde). Nous avons eu moins de succès avec les fluorescents protocole d'hybridation…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Paraformaldehyde 16% solution, EM Grade		Electron Microscopy Services	15710	Dilute to 4% in 1.33x PBS (final 1x). Store in 2ml aliquots at –20°C
Proteinase K, recombinant PCR grade		Roche	03115879001	Make a 20mg/ml stock solution in water. Store in 1ml aliquots at –20°C
Blocking Reagent		Roche	11096176001	Make a 10% stock solution in 1x maleic acid buffer. Store in 50ml aliquots at –20°C. Stable over multiple freeze/thaws.
Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments		Roche	11426346910	Aliquot and store at -20°C. Keep one working aliquot at 4°C.
Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments		Roche	11207739910	As above.
TSA Plus Fluorescein system		Perkin Elmer	NEL741001KT	Prepare each vial of TSA reagent only when needed. Dissolve in 60μl DMSO. Store at 4°C.
TSA Plus Cyanine5 system		Perkin Elmer	NEL745001KT	As above
TSA Plus Cyanine3 system		Perkin Elmer	NEL744001KT	As above
TSA Kit #16 AlexaFluor647 tyramide (plus HRP-goat-anti-rabbit IgG)		Molecular Probes /Invitrogen	T20926	Dissolve tyramide reagent in 150μl DMSO, aliquot and store at –20°C.
RNase, DNase free		Roche	11119915001	Supplied as 500μg/ml solution
Propidium Iodide		Molecular Probes /Invitrogen	P-3566	Supplied as 1mg/ml solution in water.