斑马鱼整装高分辨率双荧光原位杂交
Summary
整装原位杂交是发育生物学中最广泛使用的技术之一。在这里，我们提出一个高分辨率的双荧光原位杂交协议分析一个单一的基因精确的表达模式，并确定两个基因的表达域重叠。我们包括核反击一个碘化丙啶染色，以突出组织机构。
Abstract
整装<em>原位</em>杂交是发育生物学中最广泛使用的的技术之一。在这里，我们提出了一个高分辨率的双荧光<em>原位</em>为一个单一的基因精确的表达模式分析和确定两个基因的表达域重叠的杂交的协议。该协议是一个标准的修改后的版本<em>原位</em>杂交利用碱性磷酸酶和NBT / BCIP显和快速红如基板<sup> 1,2</sup>。该协议利用酪胺信号放大（TSA）的标准digoxygenin和荧光标记的探针<sup> 3</sup>。市售的TSA套件允许各种核污渍，如碘化丙啶，或荧光蛋白免疫组织化学，灵活的荧光发射的实验设计，从绿色到远红光可结合使用。 TSA产生的反应的荧光底物，快速共价键结合的基团，通常的酪氨酸残基在紧邻的标记的反义riboprobe，。染色模式，亚细胞定位的mRNA高分辨率使用激光扫描共聚焦显微镜可观察到<sup> 3,4</sup>。在染色体位点，人们可以观察到新生的成绩单，分清细胞核和细胞质染色和可视化等皮质定位的mRNA模式。在研究<em>果蝇</em>表明，大约有70％的mRNA表现经常与编码的蛋白质的功能相关的亚细胞定位的具体模式<sup> 5</sup>。结合计算机辅助三维共焦数据集重建时，我们的协议允许的mRNA的亚细胞分布在整个脊椎动物胚胎的决议的详细分析。
Protocol
Discussion
这里提出的协议的工作原理以及与染色30-45分钟后，在一个典型的碱性磷酸酶介导的反应，让一个干净的强烈信号的探针。执行的荧光原位杂交协议之前，我们总是考验我们的探头，使用标准的非荧光协议（探针合成协议提供补充材料）。使用较弱的探针时，我们曾成功与荧光原位杂交协议，但它可能在某些情况下可能。我们已经成功地结合起来，与β- catenin的3免疫定位的荧光原位杂交协…
Acknowledgements
我们要认识到，在发展本议定书Dörthe利希，珍妮回合和安德鲁马拉的贡献。 NICHD的，美国癌症协会和March of Dimes的提供的研究支持。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Paraformaldehyde 16% solution, EM Grade | Electron Microscopy Services | 15710 | Dilute to 4% in 1.33x PBS (final 1x). Store in 2ml aliquots at –20°C | |
| Proteinase K, recombinant PCR grade | Roche | 03115879001 | Make a 20mg/ml stock solution in water. Store in 1ml aliquots at –20°C | |
| Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | Make a 10% stock solution in 1x maleic acid buffer. Store in 50ml aliquots at –20°C. Stable over multiple freeze/thaws. | |
| Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments | Roche | 11426346910 | Aliquot and store at -20°C. Keep one working aliquot at 4°C. | |
| Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments | Roche | 11207739910 | As above. | |
| TSA Plus Fluorescein system | Perkin Elmer | NEL741001KT | Prepare each vial of TSA reagent only when needed. Dissolve in 60μl DMSO. Store at 4°C. | |
| TSA Plus Cyanine5 system | Perkin Elmer | NEL745001KT | As above | |
| TSA Plus Cyanine3 system | Perkin Elmer | NEL744001KT | As above | |
| TSA Kit #16 AlexaFluor647 tyramide (plus HRP-goat-anti-rabbit IgG) | Molecular Probes /Invitrogen | T20926 | Dissolve tyramide reagent in 150μl DMSO, aliquot and store at –20°C. | |
| RNase, DNase free | Roche | 11119915001 | Supplied as 500μg/ml solution | |
| Propidium Iodide | Molecular Probes /Invitrogen | P-3566 | Supplied as 1mg/ml solution in water. |
References
- Schulte-Merker, S., Ho, R. K., Herrmann, B. G., Nüsslein-Volhard, C. The protein product of the zebrafish homologue of the mouse T-gene is expressed in nuclie of the germ ring and the notochord of the early embryo. Development. 116, 1021-1027 (1992).
- Jowett, T. Double in situ hybridization techniques in zebrafish. Methods. 23, 345-358 (2001).
- Jülich, D. beamter/deltaC and the role of Notch ligands in the zebrafish somite segmentation, hindbrain neurogenesis and hypochord differentiation. Dev Biol. 286, 391-404 (2005).
- Mara, A., Schroeder, J., Chalouni, C., Holley, S. A. Priming, Initiation and Synchronization of the Segmentation Clock by deltaD and deltaC. Nat Cell Biol. 9, 523-530 (2007).
- Lecuyer, E. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
