蛋白质 - 蛋白质相互作用的双分子荧光互补的烟草原生质体和叶片可视化
Summary
蛋白质复合物在体内的形成可以通过双分子荧光互补可视化。合作伙伴的互动融合，以荧光标记的互补部件和瞬时表达烟叶，导致后两种蛋白质的接近改组后的荧光信号。
Abstract
许多蛋白质相互作用的瞬时与其他蛋白质或集成到多蛋白复合物以发挥其生物学功能。双分子荧光互补（附设）是一种体内方法来监控在植物细胞中这种相互作用。在所提出的协议所研究的候选蛋白融合至荧光蛋白互补的两半，并在各自的结构是通过农杆菌介导的转化导入植物细胞。随后，将蛋白质瞬时表达在烟草叶和还原的的荧光信号可以在完整的细胞共聚焦激光扫描显微镜来检测。这允许相互作用本身不仅可视化，而且还蛋白复合物的亚细胞定位可以被确定。为此目的，含有荧光标记的标记基因可以一起附设构建体共表达，从而可视化的细胞结构，如叔他面内质网，线粒体，高尔基体或质膜。荧光信号可以直接在表皮叶细胞或单原生质体，可从转化的烟草叶容易地分离出被监控。附设非常适合于活细胞内研究在其自然环境中的蛋白质 – 蛋白质相互作用。然而，它必须被认为表达必须通过强启动子来驱动，而相互作用伙伴由于融合了相对大的荧光标记，这可能与交互机制干扰的修改。然而，附设是一个很好的补充方法，其它常用的方法研究蛋白质-蛋白质相互作用，如免疫共沉淀， 体外下拉测定法或酵母双杂交实验。
Introduction
研究蛋白质复合物的形成和它们在植物细胞在体内的定位是必不可少的探讨蜂窝网络，信号和代谢过程。附设允许的蛋白质-蛋白质相互作用可视化直接在活体植物细胞1-5在他们的自然环境。
在附设接近的荧光蛋白引到一个重组荧光蛋白2非荧光性的N-和C-末端片段的互补。许多不同的荧光蛋白的片段已被用于检测蛋白质相互作用， 例如绿色荧光蛋白（GFP），其中由三种不同的残基6化学键形成的发色团。荧光蛋白可以在循环或β-链以产生两个非荧光片段可以被融合到感兴趣的两种蛋白质内减半。该测定可用于检测任何亚细胞compartme相互作用nt的任何需氧生长的生物体或细胞，可以进行基因修饰以表达融合蛋白。如果这两种蛋白进入细胞内的接近，荧光被重构，并且可以通过显微镜，而不添加外源荧光团或染料3来监控。
烟草（ 本氏烟 ）已被证明是方便的模型有机体可视化植物蛋白质的相互作用，因为蛋白质可以容易地通过利用烟叶与所产生的构建体农杆菌介导的转化来表达。农杆菌使用一个所谓的Ti质粒（肿瘤诱导）编码介导感兴趣的基因转导到植物细胞中的酶。附设是很好适用于水溶性以及对所有细胞区室中的膜蛋白，并已成功地用于在过去几年，以确定在体内相互作用的蛋白质，以及对分析相互作用位点内蛋白质7-9。待导入的基因表达，荧光蛋白的相互作用，可以直接在叶片可视化，这是适合于较大的蜂窝结构，如内质网（ER），在质膜或叶绿体。然而，为了监视在更精细的结构定位，例如，叶绿体被膜，最好是可视化的荧光在原生质体从转化的烟草叶中分离。一组含有任一C-末端或N-末端的荧光标记有用于在植物10的附设方法附设载体。在下文中描述的协议被用来研究细胞内的热休克蛋白90（HSP90）的相互作用与三十四肽重复含蛋白质对接Toc64和AtTPR7居住在叶绿体外封套和内质网，分别11-13（TPR）结构域。为了这个目的，HSP90融合到的CtSCFP（SCFP C）的erminal一部分。标签上还有N端融合到伴侣，以确保HSP90的C-末端MEEVD结合基序钳型TPR结构域的可访问性。与此同时，金星（金星N）的N-末端部分融合到含有蛋白质对接Toc64和AtTPR7分别TPR结构域的胞内域。作为阴性对照，我们克隆SCFP 的C可溶性C-末端部分完全驻留在细胞质中，因此适当的控制。
所研究的蛋白质的荧光标记要面对同样的细胞区室，让靠近，从而荧光信号的重建。来确定重构的荧光信号稠合到不同荧光标签标记的蛋白质可共转化来演示的相互作用的亚细胞定位的定位。融合到mCherrry一个ER标志物蛋白的同时转化案例位于AtTPR7 14急诊室的。叶绿素的自发荧光担任叶绿体标记的情况下Toc64的。通过这不仅Toc64和AtTPR7，分别与胞质HSP90分子伴侣的体内相互作用，可以直接在烟草叶片监测，但也相互作用的亚细胞定位可以进行调查。
附设很适合作为一种补充的方法来研究蛋白质 – 蛋白质相互作用的其它方法。相比于免疫共沉淀或体外下拉实验，例如，没有特异性抗体必须是可用于感兴趣的蛋白质，以及这些蛋白质没有被重组表达在体外 ，它可以是具有挑战性的，特别是对于膜蛋白。此外，也瞬时相互作用可以利用附设监视，因为蛋白质是由稠合的荧光标签15的相互作用捕获。
Protocol
Representative Results
Discussion
当规划一个附设实验几点应予以考虑。虽然对感兴趣的蛋白质没有结构信息是必需的，拓扑与跨膜蛋白质工作时是已知的。荧光蛋白必须驻留在同一个亚细胞区室或面对的膜，以允许相互作用的同一侧。自然地，分析这需要一个N-末端的定位序列的蛋白质时，只有一个C-末端标签可以考虑的。因为它是可能的标记干扰感兴趣的蛋白质，最好是预先测试的亚细胞定位，例如，通过表达GFP标记的蛋白的…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们要感谢于尔根索尔的有益讨论和克里斯嘉莉的手稿的批判性阅读。该项目资助的东风集团和全宗DER chemischen工业公司（补助号SFB 1035项目A04至SS和做二十二分之一百八十七到RS）通过。
Materials
| 3',5'-Dimethoxy-4'-hydroxyacetophenone | Sigma-Aldrich | D134406 | Acetosyringone |
| Cellulase, Onozuka-R10 | Serva | 16419 | from Trichoderma viridae |
| Macerozyme R-10 | Serva | 28302 | from Rhizopus sp |
| GATEWAY, BP Clonase II, Enzyme Kit | Invitrogen | 11789-(020) | |
| GATEWAY, LR Clonase II, Enzyme Kit | Invitrogen | 11791-(020) | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609-250 | |
| pDEST-GWVYNE | Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant | Gateway-cloning (Invitrogen) | |
| pDEST-VYNE(R)GW | Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant | Gateway-cloning (Invitrogen) | |
| pDEST-SCYCE(R)GW | Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant | Gateway-cloning (Invitrogen) | |
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