חלבונים אינטראקציות דמיינו ידי bimolecular הקרינה complementation בProtoplasts הטבק ועלים
Summary
היווצרות של קומפלקסי חלבוני in vivo ניתן דמיינו ידי שלמת הקרינה bimolecular. שותפי אינטראקציה הם התמזגו לחלקי משלימים של תגי ניאון והביעו transiently בי טבק, וכתוצאה מכך אות ניאון מחדש על סמיכות של שני חלבונים.
Abstract
חלבונים רבים האינטראקציה transiently עם חלבונים אחרים או משולבים מתחמי חלבון רב כדי לבצע את תפקידם הביולוגי. שלמת bimolecular פלואורסצנטי (BiFC) היא שיטת in vivo כדי לפקח כגון אינטראקציות בתאי צמח. בפרוטוקול המובא חלבוני המועמד חקרו הם התמזגו לחצאים משלימים של חלבוני ניאון ומבני בהתאמה מוכנסי תאי צמח באמצעות שינוי בתיווך Agrobacterium. בהמשך לכך, החלבונים באים לידי ביטוי בtransiently עלי טבק וניתן לאתר אותות ניאון המשוחזר עם לייזר סריקת מיקרוסקופ confocal בתאים שלמים. זה מאפשר הדמיה לא רק של האינטראקציה עצמה, אלא גם לוקליזציה subcellular של קומפלקסי החלבונים ניתן לקבוע. לצורך כך, ניתן coexpressed גנים סמן המכילים תג ניאון יחד עם מבני BiFC, וכך לדמיין מבנים הסלולר כגון tהוא endoplasmic reticulum, מיטוכונדריה, מנגנון Golgi או קרום הפלזמה. אות הניאון ניתן לנטר באופן ישיר בתאי עלה אפידרמיס או בprotoplasts הבודד, אשר יכול להיות מבודד בקלות מהעלים הטבק השתנו. BiFC הוא אידיאלי ללמוד אינטראקציות בין חלבונים בסביבה הטבעית שלהם בתוך התא החי. עם זאת, יש לו כדי להיחשב כי הביטוי צריך להיות מונע על ידי יזמים חזקים וששותפי האינטראקציה משתנים עקב שילוב של תגי הקרינה גדולים יחסית, מה שעלול להפריע למנגנון האינטראקציה. עם זאת, BiFC הוא גישה משלים מצוינת לשיטות נפוצות מיושמות אחרות חוקרים אינטראקציות בין חלבונים, כגון coimmunoprecipitation, במבחני חוץ גופית נפתחים או ניסויי שמרים ושניים-היברידיים.
Introduction
לומד את היווצרות של קומפלקסי חלבונים והלוקליזציה שלהם בתאי צמח in vivo היא חיונית כדי לחקור רשתות סלולריות, איתות ותהליכי חילוף חומרים. BiFC מאפשר הדמיה של אינטראקציות בין חלבונים בסביבה הטבעית שלהם ישירות בתוך תא הצמח החי 1-5.
בBiFC להתקרב לשלמה של שני שברי N-ו-C-מסוף nonfluorescent של עופרת חלבון פלואורסצנטי לחלבון פלואורסצנטי מחדש. שברי חלבוני ניאון רבים ושונים שימשו כדי לזהות אינטראקציות חלבון, למשל החלבון פלואורסצנטי הירוק (GFP) כרומופור של אשר נוצר כימי על ידי שלוש שאריות שונות 6. ניתן לחצות חלבוני ניאון בתוך לולאה או SS-גדיל להביא שני שברי nonfluorescent אשר ניתן התמזגו שני החלבונים של עניין. Assay יכול לשמש כדי לזהות אינטראקציות בכל compartme subcellularnt בכל אורגניזם גדל אירובי או תאים שיכולים להיות מהונדס גנטי כדי לבטא חלבוני ההיתוך. אם שני החלבונים באים בסמיכות בתוך התא, הקרינה היא מחדש והוא יכול להיות במעקב על ידי מיקרוסקופ ללא התוספת של fluorophores או צבעים 3 אקסוגניים.
טבק (benthamiana Nicotiana) הוכיח להיות אורגניזם מודל נוח לדמיין את האינטראקציה של חלבונים צמחיים, שכן בקלות ניתן לבטא חלבונים על ידי ניצול שינוי בתיווך Agrobacterium של טבק עם המבנים שנוצרו. Agrobacteria להשתמש פלסמיד שנקרא Ti (גידול גרימת) קידוד עבור אנזימים שלתווך התמרה של הגן של עניין לתאי צמח. BiFC הוא גם ישים עבור מסיס, כמו גם לחלבוני קרום בתוך כל התאים הסלולריים ושמש בהצלחה בשנים האחרונות לזהות אינטראקציה חלבוני in vivo, כמו גם לנתח אתרי אינטראקציהבתוך החלבונים 7-9. על הביטוי של הגנים הציגו, את האינטראקציה של חלבוני הניאון ניתן דמיינו ישירות בעלים, אשר מתאימה למבנים הסלולר גדולים יותר, כמו reticulum endoplasmic (ER), קרום הפלזמה או כלורופלסטים. עם זאת, כדי לפקח על הלוקליזציה במבנים מעודנים יותר, למשל, את מעטפת הכלורופלסט, רצוי לדמיין את הקרינה בprotoplasts מבודדת מעלי טבק השתנו. קבוצה של וקטורי BiFC המכילים גם C-מסוף או תג ניאון N-מסוף צריך לשמש לגישת BiFC בצמחי 10. הפרוטוקול המתואר להלן שימש כדי לחקור את האינטראקציה חלבון cytosolic הלם חום 90 (Hsp90) של עם חוזר tetratricopeptide תחום (TPR) המכיל חלבוני עגינת Toc64 וAtTPR7 מתגוררים במעטפת החיצונית הכלורופלסט וreticulum endoplasmic, בהתאמה 11-13. לצורך כך, Hsp90 היה התמזגו לCtחלק erminal של SCFP (SCFP C). התג היה N-סופני התמזגו למלווה כדי להבטיח נגישות של המוטיב בטרמינל C-MEEVD המחייב של Hsp90 כדי לצבוט מסוג תחומים TPR. במקביל, חלק N-המסוף של ונוס (Venus N) היה התמזגו לתחומי cytosolic של תחום TPR המכיל חלבוני עגינת Toc64 וAtTPR7, בהתאמה. כביקורת שלילית שאנו משובטים חלק מסיס בטרמינל C-C של SCFP אך ורק בו מתגורר בcytosol ולכן שליטה מתאימה.
תגי הניאון של החלבונים למדו צריכים להתמודד באותו תא סלולארי כדי לאפשר לסמיכות ובכך הכינון מחדש של אות הניאון. כדי לקבוע את הלוקליזציה של אות הניאון מחדש חלבון סמן התמזגו לתג ניאון שונה ניתן cotransformed כדי להדגים את לוקליזציה subcellular של האינטראקציה. חלבון סמן ER התמזגו mCherrry הפך בו זמנית במקרה של ER ממוקם 14 AtTPR7. Autofluorescence של כלורופיל שימש כסמן הכלורופלסט במקרה של Toc64. לפי זה לא רק האינטראקציה in vivo של Toc64 וAtTPR7, בהתאמה, עם מלווה Hsp90 cytosolic ניתן לנטר ישירות בי הטבק אלא גם לוקליזציה subcellular של האינטראקציה יכולה להיחקר.
BiFC מתאים גם כגישה משלים לשיטות אחרות לומדות אינטראקציות בין חלבונים. בהשוואה לcoimmunoprecipitation או בניסויים נפתחים מבחנה, למשל, אין נוגדנים ספציפיים צריכים להיות זמין לחלבונים של עניין, והחלבונים לא צריכים לבוא לידי ביטוי recombinantly במבחנה, מה שיכול להיות מאתגר, במיוחד לחלבונים בממברנה. יתר על כן, גם ניתן לנטר אינטראקציות חולפות באמצעות BiFC, שכן החלבונים שנתפסו על ידי האינטראקציה של תגי הניאון התמזגו 15.
Protocol
Representative Results
Discussion
על תכנון ניסוי BiFC כמה נקודות צריכה להיחשב. למרות שאין מידע מבני על החלבונים של העניין נדרש, טופולוגיה צריכה להיות ידועה בעת עבודה עם חלבוני קרום פורש. חלבוני הניאון צריכים להתגורר באותו התא subcellular או פנים באותו הצד של קרום כדי לאפשר אינטראקציה. באופן טבעי, בעת ניתוח חל…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות ליורגן סול לדיונים מועילים וכריס קארי לקריאה ביקורתית של כתב היד. פרויקט זה מומן על ידי chemischen DFG וFonds der Industrie (SFB מספרי מענקים 1035, A04 פרויקט לאס והאם 187/22 לRS).
Materials
| 3',5'-Dimethoxy-4'-hydroxyacetophenone | Sigma-Aldrich | D134406 | Acetosyringone |
| Cellulase, Onozuka-R10 | Serva | 16419 | from Trichoderma viridae |
| Macerozyme R-10 | Serva | 28302 | from Rhizopus sp |
| GATEWAY, BP Clonase II, Enzyme Kit | Invitrogen | 11789-(020) | |
| GATEWAY, LR Clonase II, Enzyme Kit | Invitrogen | 11791-(020) | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609-250 | |
| pDEST-GWVYNE | Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant | Gateway-cloning (Invitrogen) | |
| pDEST-VYNE(R)GW | Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant | Gateway-cloning (Invitrogen) | |
| pDEST-SCYCE(R)GW | Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant | Gateway-cloning (Invitrogen) | |
References
- Citovsky, V., et al. Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta. J. Mol. Biol. 362, 1120-1131 (2006).
- Schutze, K., Harter, K., Chaban, C. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to study protein-protein interactions in living plant cells. Methods Mol. Biol. 479, 189-202 (2009).
- Weinthal, D., Tzfira, T. Imaging protein-protein interactions in plant cells by bimolecular fluorescence complementation assay. Trends Plant Sci. 14, 59-63 (2009).
- Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. The analysis of protein-protein interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation. Plant Physiol. 145, 1090-1099 (2007).
- Ohad, N., Yalovsky, S. Utilizing bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to assay protein-protein interaction in plants. Methods Mol. Biol. 655, 347-358 (2010).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Lee, L. Y., et al. Screening a cDNA library for protein-protein interactions directly in planta. Plant Cell. 24, 1746-1759 (2012).
- McFarlane, H. E., Shin, J. J., Bird, D. A., Samuels, A. L. Arabidopsis ABCG transporters, which are required for export of diverse cuticular lipids, dimerize in different combinations. Plant Cell. 22, 3066-3075 (2010).
- Dunschede, B., Bals, T., Funke, S., Schunemann, D. Interaction studies between the chloroplast signal recognition particle subunit cpSRP43 and the full-length translocase Alb3 reveal a membrane-embedded binding region in Alb3 protein. J. Biol. Chem. 286, 35187-35195 (2011).
- Gehl, C., Waadt, R., Kudla, J., Mendel, R. R., Hansch, R. New GATEWAY vectors for high throughput analyses of protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation. Mol. Plant. 2, 1051-1058 (2009).
- Qbadou, S., et al. The molecular chaperone Hsp90 delivers precursor proteins to the chloroplast import receptor Toc64. EMBO J. 25, 1836-1847 (2006).
- Schweiger, R., Muller, N. C., Schmitt, M. J., Soll, J., Schwenkert, S. AtTPR7 is a chaperone docking protein of the Sec translocon in Arabidopsis. J. Cell Sci. , (2012).
- Schweiger, R., S, S. AtTPR7 as part of the Arabidopsis Sec post-translocon. Plant Signal Behav. 8, (2013).
- Nelson, B. K., Cai, X., Nebenfuhr, A. A multicolored set of in vivo organelle markers for co-localization studies in Arabidopsis and other plants. Plant J. 51, 1126-1136 (2007).
- Kerppola, T. K. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis as a probe of protein interactions in living cells. Annu. Rev. Biophys. 37, 465-487 (2008).
- Koop, H. U., et al. Integration of foreign sequences into the tobacco plastome via polyethylene glycol-mediated protoplast transformation. Planta. 199, 193-201 (1996).
