Interactions protéine-protéine visualisés par fluorescence bimoléculaire complémentation en protoplastes de tabac et des feuilles

Summary

La formation de complexes de protéines in vivo peut être visualisé par fluorescence bimoléculaire complémentation. partenaires d'interaction sont fusionnés à des parties complémentaires de marqueurs fluorescents et exprimés transitoirement dans des feuilles de tabac, ce qui entraîne un signal fluorescent reconstitué à proximité des deux protéines.

Abstract

De nombreuses protéines interagissent avec d'autres protéines de façon transitoire ou sont intégrés dans des complexes multi-protéiques de remplir leur fonction biologique. Complémentation de fluorescence bimoléculaire (BiFC) est une méthode in vivo de surveiller ces interactions dans les cellules végétales. Dans le protocole présenté les protéines candidates sont fusionnées à l'enquête moitiés complémentaires de protéines fluorescentes et les produits d'assemblage respectifs sont introduits dans des cellules végétales par transformation médiée par Agrobacterium. Par la suite, les protéines sont exprimées de manière transitoire dans les feuilles de tabac et les signaux fluorescents restaurées peuvent être détectés avec un microscope confocal à balayage laser dans les cellules intactes. Ceci permet non seulement la visualisation de l'interaction elle-même, mais aussi la localisation subcellulaire des complexes de protéines peut être déterminée. A cet effet, des gènes marqueurs contenant un marqueur fluorescent peuvent être co-exprimés avec les constructions BiFC, visualisant ainsi des structures cellulaires telles que la til reticulum endoplasmique, les mitochondries, l'appareil de Golgi ou la membrane plasmique. Le signal de fluorescence peut être contrôlée soit directement dans les cellules épidermiques des feuilles ou dans des protoplastes isolés, qui peuvent être facilement isolés à partir des feuilles de tabac transformées. BiFC est idéal pour étudier les interactions protéine-protéine dans leur milieu naturel au sein de la cellule vivante. Cependant, il doit être considéré que l'expression doit être entraînée par des promoteurs forts et que les partenaires d'interaction sont modifiées en raison de la fusion des balises relativement importantes de fluorescence, qui pourraient interférer avec le mécanisme d'interaction. Néanmoins, BiFC est une excellente approche complémentaire à d'autres méthodes couramment appliquées enquête interactions protéine-protéine, comme coimmunoprécipitation, essais in vitro déroulants ou des expériences de levure double hybride.

Introduction

L'étude de la formation de complexes de protéines et de leur localisation dans les cellules végétales in vivo est essentielle pour étudier les réseaux cellulaires, de signalisation et les processus métaboliques. BiFC permet la visualisation des interactions protéine-protéine dans leur environnement naturel directement à l'intérieur de la cellule de plante vivante ^1-5.

Dans le BiFC approcher la complémentation de deux fragments N-et C-terminaux d'une protéine non fluorescentes plomb fluorescent pour une protéine fluorescente reconstitué. Des fragments de nombreuses protéines fluorescentes différentes ont été utilisées pour détecter les interactions entre protéines, par exemple la protéine fluorescente verte (GFP) de la chromophore qui est chimiquement formée par trois résidus distincts ^6. Les protéines fluorescentes peuvent être réduites de moitié dans une boucle ou ß-brin pour donner les deux fragments non fluorescentes qui peuvent être fusionnés aux deux protéines d'intérêt. Le dosage peut être utilisé pour détecter des interactions dans toute compartme subcellulairent dans un organisme ou des cellules en croissance en milieu aérobie qui peut être génétiquement modifiée pour exprimer les protéines de fusion. Si les deux protéines sont en proximité étroite à l'intérieur de la cellule, la fluorescence est reconstitué et peut être surveillée par microscopie sans addition de fluorophores exogènes ou des colorants ^3.

Le tabac (Nicotiana benthamiana) s'est avéré être un organisme modèle commode pour visualiser l'interaction des protéines de plantes, étant donné que les protéines peuvent facilement être exprimées en utilisant une transformation médiée par Agrobacterium de feuilles de tabac avec les constructions générées. Agrobactéries utilisent un plasmide Ti dite (tumeur induisant) codant pour des enzymes qui interviennent dans la transduction du gène d'intérêt dans des cellules végétales. BiFC est bien applicable pour solubles ainsi que pour les protéines de la membrane au sein de tous les compartiments cellulaires et a été utilisé avec succès au cours des dernières années pour identifier des protéines qui interagissent in vivo, ainsi que pour analyser les sites d'interactiondans les protéines ^7-9. Lors de l'expression des gènes introduits, l'interaction des protéines fluorescentes peuvent être visualisées directement en feuille, qui est approprié pour des structures cellulaires plus gros, tels que le reticulum endoplasmique (ER), la membrane plasmatique ou les chloroplastes. Toutefois, pour contrôler la localisation dans des structures plus fines, par exemple, l'enveloppe des chloroplastes, il est souhaitable de visualiser la fluorescence dans des protoplastes isolés à partir de feuilles de tabac transformées. Un ensemble de vecteurs BiFC contenant soit un C-terminal ou un marqueur fluorescent N-terminale doit être utilisée pour l'approche BiFC dans des plantes ^10. Le protocole décrit de la suite a été utilisé pour étudier l'interaction de cytosolique protéine de choc thermique 90 (HSP90) avec la répétition de tetratricopeptide (TPR) de domaine contenant des protéines d'amarrage Toc64 et AtTPR7 résidant dans l'enveloppe extérieure du chloroplaste et le réticulum endoplasmique, respectivement ^11-13. A cet effet, HSP90 a été fusionné à la Ctpartie de erminal SCFP (SCFP ^C). La balise était N-terminale fusionnée à la protéine chaperon pour assurer l'accessibilité du motif C-terminal MEEVD liaison de HSP90 pour serrer de type domaines TPR. En parallèle, la partie N-terminale de Vénus (Venus ^N) a été fusionné aux domaines cytosoliques du domaine TPR contenant des protéines d'amarrage Toc64 et AtTPR7, respectivement. Comme témoin négatif nous avons cloné la partie C-terminale soluble SCFP ^C uniquement qui réside dans le cytosol et est donc un contrôle approprié.

Les marqueurs fluorescents de protéines étudiées doivent faire face à la même compartiment cellulaire pour permettre proximité et ainsi la reconstitution du signal fluorescent. Pour déterminer la localisation du signal fluorescent reconstitué une protéine marqueur fusionnée à une étiquette fluorescente différente peut être co-transformée à démontrer la localisation subcellulaire de l'interaction. Une protéine servant de marqueur ER fusionnée à mCherrry a été transformé simultanément à l'cas de l'ER situé AtTPR7 ^14. L'auto-fluorescence de la chlorophylle a servi de marqueur chloroplaste en cas de Toc64. Par cela, non seulement l'interaction in vivo de Toc64 AtTPR7 et, respectivement, avec le chaperon HSP90 cytosolique peut être surveillée directement dans les feuilles de tabac, mais aussi la localisation subcellulaire de l'interaction peut être étudiée.

BiFC est bien adapté comme une approche complémentaire à d'autres méthodes qui étudient les interactions protéine-protéine. Par rapport aux co-immunoprécipitation ou in vitro des expériences d'excursion basse, par exemple, pas d'anticorps spécifiques doivent être disponibles pour des protéines d'intérêt, et les protéines n'ont pas à être exprimé par recombinaison in vitro, ce qui peut être difficile, en particulier pour les protéines de la membrane. De plus, aussi les interactions transitoires peuvent être surveillés à l'aide BiFC, étant donné que les protéines sont capturées par l'interaction des marqueurs fluorescents fusionnées ^15.

Protocol

Une. Transformation de BiFC Construit en Agrobacteria Le clonage de constructions BiFC Amplifier le gène d'intérêt à partir d'un modèle approprié, en utilisant des oligonucleotides contenant des sites attB encadrant. Effectuez une PCR en utilisant une polymérase de relecture. Adapter la longueur de l'étape de recuit de la combinaison d'amorces conçues et la durée de l'étape d'élongation en fonction de la taille des fragments. Vérifier le produit de PCR par électr…

Representative Results

Dans cet exemple, nous avons utilisé la méthode BiFC pour surveiller l'interaction entre le chaperon moléculaire de HSP90 cytosolique des protéines membranaires amarrage AtTPR7 et Toc64. AtTPR7 fait partie du translocon Sec et interagit avec les chaperons cytosoliques, qui délivrent éventuellement préprotéines sécrétoires pour la translocation post-traductionnelle de la membrane du RE. De même, Toc64 à l'enveloppe extérieure chloroplaste agit dans l'importation post-traductionnelle en recevant H…

Discussion

Lors de la planification d'une expérience BiFC plusieurs points doivent être considérés. Bien qu'aucune information structurale sur les protéines d'intérêt est requise, la topologie doit être connu lorsque l'on travaille avec des protéines de la membrane couvrant. Les protéines fluorescentes doivent se trouver dans le même compartiment sous-cellulaire ou orientés dans le même côté d'une membrane pour permettre l'interaction. Naturellement, lorsque l'on analyse les protéines qu…

Materials

3',5'-Dimethoxy-4'-hydroxyacetophenone	Sigma-Aldrich	D134406	Acetosyringone
Cellulase, Onozuka-R10	Serva	16419	from Trichoderma viridae
Macerozyme R-10	Serva	28302	from Rhizopus sp
GATEWAY, BP Clonase II, Enzyme Kit	Invitrogen	11789-(020)
GATEWAY, LR Clonase II, Enzyme Kit	Invitrogen	11791-(020)
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit	Macherey-Nagel	740609-250
pDEST-GWVYNE		Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant	Gateway-cloning (Invitrogen)
pDEST-VYNE(R)GW		Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant	Gateway-cloning (Invitrogen)
pDEST-SCYCE(R)GW		Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant	Gateway-cloning (Invitrogen)