담배 원형질체 및 잎에 이분자 형광 보완에 의해 시각 단백질 - 단백질 상호 작용
Summary
생체 내에서 단백질 복합체의 형성은 이분자 형광 보완하여 시각하실 수 있습니다. 상호 작용 파트너는 형광 태그의 보완적인 부분에 융합 일시적으로 담배 잎으로 표현, 두 단백질의 근접에 따라 재구성 형광 신호의 결과로되어있다.
Abstract
많은 단백질은 다른 단백질과 상호 작용을 일시적으로 또는 생물학적 기능을 수행하기 위해 다중 단백질 복합체에 통합되어 있습니다. 이분자 형광 보완 (BiFC)는 식물 세포에서 이러한 상호 작용을 모니터링 할 수있는 생체 내 방법입니다. 제시된 프로토콜 추궁 후보 단백질이 형광 단백질의 상보 반쪽에 융합되고, 각 구조물은 아그로 박테 리움 – 매개 형질 전환을 통해 식물 세포 내로 도입된다. 이어서, 단백질은 일시적으로 담배 잎에서 발현되고 복원 된 형광 신호는 그대로 셀의 공 초점 레이저 주사 현미경으로 검출 할 수있다. 이것은 상호 작용 자체뿐만 아니라 시각화를 허용하지만, 또한 단백질 복합체의 세포 내 지역화는 결정될 수있다. 이를 위해, 형광 태그를 함유하는 표지 유전자는 이와 같은 t 셀룰러 구조를 시각화 BiFC 구조와 함께 공 발현 될 수있다그는 세망, 미토콘드리아, 골지체 또는 원형질막을 세포질. 형광 신호를 직접 표피 잎 세포 또는 쉽게 변형 담배 잎으로부터 단리 할 수있다 단일 원형질체에서 모니터링 할 수있다. BiFC 이상적으로 살아있는 세포 내에서 자연 환경에서 단백질 – 단백질 상호 작용을 연구하기에 적합합니다. 그러나, 식 강한 프로모터에 의해 구동되어야하고 상호 작용 파트너 인해 상호 작용 메카니즘을 방해 할 수있는 비교적 큰 형광 태그의 융합으로 변성되어 있음을 고려하여야한다. 그럼에도 불구하고, BiFC는 coimmunoprecipitation 같은 단백질 – 단백질 상호 작용, 생체 풀다운 분석 또는 효모 두 하이브리드 실험을 조사하고 다른 일반적으로 적용되는 방법에 대한 훌륭한 보완적인 접근 방식입니다.
Introduction
단백질 복합체의 형성을 공부하고 생체 내에서 식물 세포에서의 현지화는 셀룰러 네트워크를 조사하는 것이 필수적입니다, 신호 및 신진 대사 과정. BiFC 직접 살아있는 식물 세포 1-5 내에서의 자연 환경에서 단백질 – 단백질 상호 작용을 시각화 할 수 있습니다.
BiFC에서 재구성 형광 단백질에 형광 단백질 리드의 두 비 형광 N-및 C-말단 조각의 보완에 접근. 많은 다른 형광 단백질의 단편은 녹색 형광 단백질 (GFP) 화학적 세 가지 잔기 (6)에 의해 형성되어있는 발색단 예 : 단백질 상호 작용을 검출하기 위해 사용되어왔다. 형광 단백질은 관심의 두 단백질에 융합 될 수있는 두 개의 비 형광 조각 될 수있는 루프 또는 ß-가닥 내 반감 될 수있다. 분석은 어떤 세포 내 compartme에 상호 작용을 검출하는데 사용될 수있다유전자 융합 단백질을 표현하기 위해 수정 될 수있는 기적으로 성장하는 유기체 또는 세포 NT. 이 단백질은 세포 내에서 근접에 오면, 형광 재구성되고 외인성 또는 형광 염료 (3)의 추가없이 현미경에 의해 모니터링 될 수있다.
단백질은 쉽게 담배 생성 구문 남긴다의 아그로 박테 리움 – 매개 형질 전환을 이용하여 표현 될 수 있기 때문에, 담배 (는 담배 benthamiana)는, 식물성 단백질의 상호 작용을 시각화하기 편리한 모델 생물로 입증되었다. 아그로 박테리아는 식물 세포로 그 유전자의 전달을 매개하는 효소를 코딩하는 소위의 Ti 플라스미드 (종양 유도)를 사용한다. BiFC는 가용성뿐만 아니라 모든 세포 구획 내에서 막 단백질 잘 적용하고 성공적으로 생체 내에서 단백질 상호 작용을 식별 할뿐만 아니라 상호 작용 사이트를 분석하기 위해 지난 몇 년 동안 사용되었습니다7-9 단백질 내. 도입 된 유전자의 발현시에, 형광 단백질의 상호 작용은 소포체 (ER), 세포막 또는 엽록체 같은 큰 셀룰러 구조 위해 적당한, 나뭇잎에 직접 시각화 될 수있다. 그러나,보다 세련된 구조에서 지역화을 모니터링, 예를 들어, 엽록체 봉투, 그것은 변형 담배 잎에서 분리 된 원형질체에서 형광을 시각화하는 것이 바람직하다. C-말단 또는 N-말단 형광 태그 식물 10 BiFC 접근을 위해 사용되어야하는 하나를 함유 BiFC 벡터들의 집합. 이하 설명 프로토콜은 tetratricopeptide 반복 도킹 단백질 Toc64 및 AtTPR7는 엽록체 외부 봉투와 각각 소포체, 11-13에 거주를 포함 (TPR) 도메인과 세포질 열 충격 단백질 90 (HSP90)의 상호 작용을 연구하는 데 사용되었다. 이를 위해, HSP90은 캐럿에 융합시켰다SCFP (SCFP C)의 erminal 부분. 태그는 N-말단 TPR 도메인 형 클램프 HSP90의 C-말단 MEEVD 결합 모티프의 접근성을 보장하기 위해 보호자에 융합했다. 병행 금성 (비너스 N)의 N-말단 부분은 도킹 단백질 각각 Toc64 및 AtTPR7을 함유 TPR 도메인의 세포질 도메인에 융합시켰다. 음성 대조군으로 우리는 세포질에 존재하고, 따라서 적절한 컨트롤입니다 전적으로 SCFP C의 수용성 C-말단 부분을 복제.
연구 단백질의 형광 태그는 근접시켜 형광 신호의 재구성을 할 수 있도록 동일한 세포 구획을 직시해야합니다. 다른 형광 태그에 융합 마커 단백질이 상호 작용의 세포 내 현지화를 보여 cotransformed 할 수있는 재구성 된 형광 신호의 지역화를 결정합니다. mCherrry에 융합 ER 마커 단백질에 동시에 형질 전환AtTPR7 14에 위치한 ER 경우. 엽록소의 형광도는 Toc64의 경우에는 엽록체 마커로 봉사했다. 이것에 의해뿐만 아니라 세포질 HSP90의 보호자와 각각 Toc64 및 AtTPR7,,의 생체 상호 작용은 담배 잎에 직접 모니터링 할 수 있습니다뿐만 아니라 상호 작용의 세포 내 현지화를 조사 할 수 있습니다.
BiFC 잘 단백질 – 단백질 상호 작용을 공부하는 다른 방법에 대한 보완 방법으로 적합합니다. coimmunoprecipitation에 또는 시험 관내 풀다운 실험에 비교하여, 예를 들면, 특정의 항체는 관심의 단백질에 해당 될 필요없고, 단백질은 특히 막 단백질에 대한 도전 일 수있는 재조합 적으로 시험 관내에서 발현 될 필요가 없다. 단백질 융합 형광 태그 (15)의 상호 작용에 의해 포착되기 때문에 더욱, 또한 과도 상호 작용은 BiFC을 사용하여 모니터링 할 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
BiFC 실험 계획에 여러 지점이 고려되어야한다. 관심의 단백질에 대한 구조적 정보가 필요하지 않지만, 토폴로지는 막 단백질에 걸친 작업을 할 때 알고 있어야합니다. 형광 단백질은 동일한 세포 내 구획에서 상주하거나 상호 작용을 허용하는 멤브레인의 동일 측면에 직면한다. N-말단 서열을 타겟팅 필요 단백질을 분석 할 때 당연히, 단지 C-말단 태그가 고려 될 수있다. 그 태그는 GFP-태그 된 단?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 원고의 비판적 읽기에 도움이 토론과 크리스 캐리에 대한 위르겐 Soll에 감사를드립니다. 이 프로젝트는 DFG 및 드퐁 데르 chemischen 인더스트리 (부여 번호 SFB 1035 SS에 프로젝트 A04 및 RS 187 개의 22 / 수행)에 의해 투자되었다.
Materials
| 3',5'-Dimethoxy-4'-hydroxyacetophenone | Sigma-Aldrich | D134406 | Acetosyringone |
| Cellulase, Onozuka-R10 | Serva | 16419 | from Trichoderma viridae |
| Macerozyme R-10 | Serva | 28302 | from Rhizopus sp |
| GATEWAY, BP Clonase II, Enzyme Kit | Invitrogen | 11789-(020) | |
| GATEWAY, LR Clonase II, Enzyme Kit | Invitrogen | 11791-(020) | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609-250 | |
| pDEST-GWVYNE | Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant | Gateway-cloning (Invitrogen) | |
| pDEST-VYNE(R)GW | Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant | Gateway-cloning (Invitrogen) | |
| pDEST-SCYCE(R)GW | Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant | Gateway-cloning (Invitrogen) | |
References
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