Tütün protoplastlarında ve Yapraklar Bimoleküler Floresan tamamlama tarafından Visualized protein-protein etkileşimleri
Summary
In vivo protein komplekslerinin oluşumu bimoleküler floresan tamamlanmasıyla görselleştirilebilir. Etkileşim ortakları floresan etiketler tamamlayıcı bölümlerine bağlı ve geçici olarak tütün yaprakları olarak ifade edilen iki protein arasında yakın üzerine yeniden flüoresan sinyal elde edilir.
Abstract
Çoğu protein, diğer proteinler ile geçici olarak etkileşebilir ya da biyolojik işlevi gerçekleştirmek için, çok-protein kompleksleri halinde entegre edilmiştir. Bimoleküler floresan tamamlama (BiFC), bitki hücrelerindeki bu tür etkileşimlerin görüntülenmesi için bir in vivo bir yöntemdir. Sunulan protokol, incelenen aday proteinlerin floresan proteinleri tamamlayıcı yarılarına kaynaşmış ve ilgili yapılan, Agrobacterium aracılı transformasyon yoluyla bitki hücrelerine dahil edilir. Daha sonra, proteinler, geçici tütün yapraklarının olarak ifade edilmiştir ve geri floresan sinyalleri sağlam hücrelerde konfokal lazer tarama mikroskobu ile tespit edilebilir. Bu etkileşimin kendisinin sadece görselleştirme sağlar, aynı zamanda protein komplekslerinin hücre içi lokalizasyonu belirlenebilir. Bu amaçla, bir fluoresan etiketi ihtiva eden marker genleri böylece bu t olarak hücresel yapılarının görselleştirme, BiFC konstruktları ile birlikte eksprese edilebilirO retikulum, mitokondri, Golgi aygıtı ya da plazma zarı endoplazmik. Flüoresan sinyal ya doğrudan yaprak epidermal hücrelerde ya da kolayca dönüştürülmüş tütün yapraklarından izole edilebilir tek protoplastlar içinde izlenebilir. BiFC ideal olarak canlı hücre içinde kendi doğal ortamda, protein-protein etkileşimleri incelemek için uygundur. Bununla birlikte, bu ifade, güçlü promotörler ile tahrik edilecek ve etkileşim ortakları nedeniyle etkileşim mekanizması ile etkileşebilir nispeten büyük floresan etiketler, füzyonu için modifiye olduğu olduğu kabul edilmelidir. Bununla birlikte, bu tür BiFC coimmunoprecipitation gibi protein-protein etkileşimleri, in vitro pull-down testleri ya da maya iki-hibrid deneylerini araştıran diğer yaygın olarak uygulanan yöntemler için mükemmel tamamlayıcı bir yaklaşımdır.
Introduction
Protein komplekslerinin oluşumunu incelenmesi ve in vivo olarak bitki hücrelerinde hücresel lokalizasyonu ağları araştırmak için gereklidir, sinyalizasyon ve metabolik süreçleri. BiFC doğrudan canlı bitki hücresine 1-5 içinde, doğal ortamda, protein-protein etkileşimleri görselleştirme sağlar.
BiFC bir yeniden floresan protein için bir floresan protein kurşun iki özelliğine sahip olmayan N-ve C-terminal parçalarının tamamlanmasını yaklaşım. Birçok farklı floresan proteinlerin fragmanları da bu, yeşil floresan proteini (GFP), kimyasal olarak üç farklı artıkları 6 tarafından oluşturulduğu bir kromofor, örneğin, protein etkileşimlerini tespit etmek için kullanılmıştır. Floresan proteinleri ilgi iki proteinlere kaynaştırılabilir iki nonfluorescent parçalarının neden olduğu bir ilmek ya da beta-iplikçik içinde yarıya indirilebilir. Deney, bir hücre içi compartme etkileşimleri tespit etmek için kullanılabilirgenetik füzyon proteinleri ifade etmek için modifiye edilebilir bir aerobik olarak büyüyen bir organizmaya veya hücrelerde nt. , Iki proteinin hücre içinde yakın ilişkiye de zorlamaktadır geliyorsa, floresan kurulur ve dışsal florofor veya boyalarla 3 ilavesi olmadan mikroskobu ile izlenebilir.
Proteinler, kolaylıkla üretilen tütün konstruktları ile yaprak arasında Agrobacterium aracılı transformasyon kullanılarak ifade edilebilir çünkü Tütün (Nicotiana benthamiana), bitki protein etkileşimini görselleştirmek için uygun bir model organizma olduğu kanıtlanmıştır. Agrobacteria bitki hücrelerine ilgi konusu genin iletimine aracılık enzim için kodlama yapan bir sözde Ti plazmidi (tümör indükleyici) kullanın. BiFC çözünür hem de bütün hücre bölmesi içinde zar proteinleri için de uygulanabilir olduğunu ve in vivo olarak başarılı bir şekilde etkileşen proteinleri tespit etmek hem de etkileşim bölgelerine analiz etmek için son yıllarda kullanılmıştır7-9 proteinler içinde. Katılan genlerin sentezlenmesi üzerine, floresan protein etkileşimi gibi, endoplazmik retikulum (ER), plazma membranı veya kloroplast gibi daha büyük hücre yapıları için uygun olan, yaprak doğrudan görselleştirilebilir. Ancak, daha fazla rafine yapılarda lokalizasyonunu izlemek için, örneğin kloroplast zarf, bu dönüştürülmüş tütün yapraklarından izole edilmiş protoplastlarda floresan görselleştirmek için tavsiye edilir. Bir C-terminal veya N-terminal floresan etiket bitkiler 10 BiFC yaklaşım için kullanılacak olan ya da ihtiva eden BiFC vektörler bir dizi. Aşağıda açıklanan protokol tetratricopeptide tekrar yanaşan proteinleri Toc64 ve AtTPR7 kloroplast dış zarf ve sırasıyla endoplazmik retikulum, 11-13 ikamet içeren (TPR) etki ile sitozolik ısı şok proteini 90 (HSP90) etkileşimini incelemek için kullanılmıştır. Bu amaçla, HSP90 Ct kaynaştırılmıştırSCFP (SCFP C) erminal parçasıdır. Etiket, N-terminal TPR etki tipte kelepçe HSP90'ın C-terminal MEEVD bağlanma motifi erişim sağlamak için şaperon kaynaşmış oldu. Buna paralel olarak, Venüs (Venus N) en N-ucu kısmı yerleştirme proteinleri sırasıyla Toc64 ve AtTPR7 içeren TPR etki sitosolik etki ile kaynaştırılır. Negatif kontrol olarak, sitosol içinde yer alır ve bu nedenle, uygun bir kontrol olarak yalnızca SCFP C çözünür C-terminal parçası klonlandı.
Üzerinde çalışılan proteinlerin floresan etiketler yakın ve bu şekilde floresan sinyalinin sulandırma izin vermek üzere, aynı hücre bölmesi yüz vardır. Farklı bir floresan etiket ile kaynaşmış bir işaretleyici protein etkileşimi hücre içi lokalizasyonu göstermek için ortak transforme edilebilir yeniden floresan sinyalinin lokalizasyonunu belirlemek. MCherrry kaynaşık bir ER markör proteinin aynı anda dönüştürülmüştürAtTPR7 14 bulunan ER durumda. Klorofil otofloresansı Toc64 durumunda kloroplast marker olarak görev yaptı. Bu sayede sadece sitosolik HSP90 ile, sırasıyla şaperon Toc64 ve AtTPR7, in vivo etkileşim tütün yapraklarının doğrudan izlenebilir değil, aynı zamanda etkileşim hücre içi lokalizasyonu araştırılabilir.
BiFC, protein-protein etkileşimlerini incelemek için diğer yöntemler için tamamlayıcı bir yaklaşım olarak uygundur. Coimmunoprecipitation ya da nitro pull-down deneylerde göre, örneğin, herhangi bir özel antikorlar ilgi konusu proteinleri için kullanılabilir olması gerekir, ve proteinler, özellikle membran proteinleri için, zor olabilir, in vitro olarak rekombinant ifade edilmesi gerekmez. Proteinler kaynaşık floresan etiketler 15 etkileşimi ile yakalanır Üstelik, aynı zamanda geçici etkileşimler, BIFC kullanılarak izlenebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bir BiFC deney planlama üzerine birkaç nokta dikkate alınmalıdır. Ilgilenilen protein ile ilgili yapısal bilgi gerekli olduğundan, topoloji zar kapsayan proteinleri ile çalışan bilinen zorundadır. Floresan proteinleri aynı hücre içi kabininde bulunan ya da etkileşim sağlamak için bir zarın aynı yan yüz gerekir. Bir N-terminal hedefleme sekansı gerekli proteinleri analiz Doğal olarak, yalnızca C-ucu işareti olarak kabul edilebilir. Bu etiket, bir GFP-etiketli proteini ifade ile, örneğin, daha ö…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz yazının eleştirel okuma için yararlı tartışmalar ve Chris Carrie için Jürgen Soll teşekkür etmek istiyorum. Bu proje DFG ve Fonds der Chemischen Industrie (hibe numaraları SFB 1035, SS proje A04 ve RS 187/22 yapın) tarafından finanse edildi.
Materials
| 3',5'-Dimethoxy-4'-hydroxyacetophenone | Sigma-Aldrich | D134406 | Acetosyringone |
| Cellulase, Onozuka-R10 | Serva | 16419 | from Trichoderma viridae |
| Macerozyme R-10 | Serva | 28302 | from Rhizopus sp |
| GATEWAY, BP Clonase II, Enzyme Kit | Invitrogen | 11789-(020) | |
| GATEWAY, LR Clonase II, Enzyme Kit | Invitrogen | 11791-(020) | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609-250 | |
| pDEST-GWVYNE | Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant | Gateway-cloning (Invitrogen) | |
| pDEST-VYNE(R)GW | Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant | Gateway-cloning (Invitrogen) | |
| pDEST-SCYCE(R)GW | Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant | Gateway-cloning (Invitrogen) | |
References
- Citovsky, V., et al. Subcellular localization of interacting proteins by bimolecular fluorescence complementation in planta. J. Mol. Biol. 362, 1120-1131 (2006).
- Schutze, K., Harter, K., Chaban, C. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to study protein-protein interactions in living plant cells. Methods Mol. Biol. 479, 189-202 (2009).
- Weinthal, D., Tzfira, T. Imaging protein-protein interactions in plant cells by bimolecular fluorescence complementation assay. Trends Plant Sci. 14, 59-63 (2009).
- Ohad, N., Shichrur, K., Yalovsky, S. The analysis of protein-protein interactions in plants by bimolecular fluorescence complementation. Plant Physiol. 145, 1090-1099 (2007).
- Ohad, N., Yalovsky, S. Utilizing bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to assay protein-protein interaction in plants. Methods Mol. Biol. 655, 347-358 (2010).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Lee, L. Y., et al. Screening a cDNA library for protein-protein interactions directly in planta. Plant Cell. 24, 1746-1759 (2012).
- McFarlane, H. E., Shin, J. J., Bird, D. A., Samuels, A. L. Arabidopsis ABCG transporters, which are required for export of diverse cuticular lipids, dimerize in different combinations. Plant Cell. 22, 3066-3075 (2010).
- Dunschede, B., Bals, T., Funke, S., Schunemann, D. Interaction studies between the chloroplast signal recognition particle subunit cpSRP43 and the full-length translocase Alb3 reveal a membrane-embedded binding region in Alb3 protein. J. Biol. Chem. 286, 35187-35195 (2011).
- Gehl, C., Waadt, R., Kudla, J., Mendel, R. R., Hansch, R. New GATEWAY vectors for high throughput analyses of protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation. Mol. Plant. 2, 1051-1058 (2009).
- Qbadou, S., et al. The molecular chaperone Hsp90 delivers precursor proteins to the chloroplast import receptor Toc64. EMBO J. 25, 1836-1847 (2006).
- Schweiger, R., Muller, N. C., Schmitt, M. J., Soll, J., Schwenkert, S. AtTPR7 is a chaperone docking protein of the Sec translocon in Arabidopsis. J. Cell Sci. , (2012).
- Schweiger, R., S, S. AtTPR7 as part of the Arabidopsis Sec post-translocon. Plant Signal Behav. 8, (2013).
- Nelson, B. K., Cai, X., Nebenfuhr, A. A multicolored set of in vivo organelle markers for co-localization studies in Arabidopsis and other plants. Plant J. 51, 1126-1136 (2007).
- Kerppola, T. K. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis as a probe of protein interactions in living cells. Annu. Rev. Biophys. 37, 465-487 (2008).
- Koop, H. U., et al. Integration of foreign sequences into the tobacco plastome via polyethylene glycol-mediated protoplast transformation. Planta. 199, 193-201 (1996).
