Interacciones proteína-proteína se visualizó por fluorescencia Bimolecular Complementación en protoplastos de tabaco y hojas

Summary

Formación de complejos de proteínas in vivo puede ser visualizado por complementación de fluorescencia bimolecular. Parejas de interacción se fusionan a partes complementarias de etiquetas fluorescentes y expresados ​​transitoriamente en hojas de tabaco, lo que resulta en una señal fluorescente reconstituido en una estrecha proximidad de las dos proteínas.

Abstract

Muchas proteínas interactúan de forma transitoria con otras proteínas o se integran en varios complejos de proteínas para llevar a cabo su función biológica. Complementación de fluorescencia bimolecular (BiFC) es un método in vivo para monitorear tales interacciones en las células vegetales. En el protocolo presentado las proteínas candidatas investigados se fusionan a mitades complementarias de proteínas fluorescentes y los respectivos constructos se introducen en las células vegetales a través de la transformación mediada por Agrobacterium. Posteriormente, las proteínas se expresan transitoriamente en hojas de tabaco y las señales fluorescentes restaurados se pueden detectar con un microscopio de barrido láser confocal en las células intactas. Esto permite no sólo la visualización de la interacción en sí misma, sino también la localización subcelular de los complejos de proteínas se puede determinar. Para este propósito, los genes marcadores que contienen una etiqueta fluorescente se pueden coexpressed junto con los constructos BiFC, visualizando de este modo las estructuras celulares tales como tél retículo endoplasmático, mitocondria, aparato de Golgi o la membrana plasmática. La señal fluorescente se puede controlar ya sea directamente en las células epidérmicas de la hoja o en protoplastos individuales, que pueden ser fácilmente aislado de las hojas de tabaco transformadas. BiFC es ideal para estudiar las interacciones proteína-proteína en su entorno natural dentro de la célula viva. Sin embargo, se tiene que considerar que la expresión tiene que ser impulsado por promotores fuertes y que los compañeros de interacción se modifican debido a la fusión de las relativamente grandes etiquetas de fluorescencia, lo que podría interferir con el mecanismo de interacción. Sin embargo, BiFC es un excelente enfoque complementario a otros métodos comúnmente aplicados investigan las interacciones proteína-proteína, como coimmunoprecipitation, vitro desplegable ensayos o experimentos en la levadura de dos híbridos.

Introduction

El estudio de la formación de complejos de proteínas y su localización en células vegetales in vivo es esencial para investigar las redes celulares, la señalización y los procesos metabólicos. BiFC permite la visualización de las interacciones proteína-proteína en su entorno natural directamente dentro de la célula de la planta de estar ^1-5.

En la BiFC acercarse a la complementación de dos fragmentos N-y C-terminales no fluorescentes de una ventaja de la proteína fluorescente a una proteína fluorescente reconstituido. Fragmentos de muchas proteínas fluorescentes diferentes se han utilizado para detectar interacciones de proteínas, por ejemplo, la proteína fluorescente verde (GFP) el cromóforo de que se forma químicamente por tres residuos distintos ^6. Proteínas fluorescentes pueden reducirse a la mitad dentro de un bucle o ß-cadena para dar lugar a los dos fragmentos no fluorescentes que se pueden fusionar a ambas proteínas de interés. El ensayo se puede usar para detectar interacciones en cualquier compartme subcelularnt en cualquier organismo aeróbicamente creciente o células que se pueden modificar genéticamente para expresar las proteínas de fusión. Si las dos proteínas entran en estrecha proximidad dentro de la célula, la fluorescencia se reconstituye y se puede monitorizar mediante microscopía sin la adición de fluoróforos o colorantes exógenos ^3.

Tabaco (Nicotiana benthamiana) ha demostrado ser un organismo modelo conveniente de visualizar la interacción de proteínas de plantas, ya que las proteínas se pueden expresar fácilmente mediante la utilización de la transformación mediada por Agrobacterium de hojas de tabaco con las construcciones generadas. Agrobacterias utilizan un plásmido Ti llamado (inductor de tumores) que codifican enzimas que median la transducción del gen de interés en células de plantas. BiFC es así aplicable para solubles, así como para proteínas de la membrana dentro de todos los compartimentos celulares y ha sido utilizado con éxito en los últimos años para identificar las proteínas que interactúan in vivo, así como para analizar sitios de interaccióndentro de las proteínas ^7-9. Tras la expresión de los genes introducidos, la interacción de las proteínas fluorescentes puede ser visualizada directamente en hojas, que es adecuado para estructuras celulares más grandes, tales como el retículo endoplasmático (ER), la membrana de plasma o cloroplastos. Sin embargo, para supervisar la localización en estructuras más refinadas, por ejemplo, la envoltura del cloroplasto, es aconsejable para visualizar la fluorescencia en protoplastos aislados a partir de hojas de tabaco transformadas. Un conjunto de vectores de BiFC que contienen ya sea un C-terminal o una etiqueta fluorescente N-terminal tiene que ser utilizado para el enfoque BiFC en las plantas ^10. El protocolo se describe más adelante se utilizó para estudiar la interacción de citosólica proteína de choque térmico 90 (HSP90) con el tetratricopeptide repetir (TPR) de dominio que contiene proteínas de acoplamiento Toc64 y AtTPR7 que residían en la envoltura exterior del cloroplasto y el retículo endoplásmico, respectivamente ^11-13. Para este propósito, la HSP90 se fusionó a la Ctparte erminal de SCFP (SCFP ^C). La etiqueta era N-terminal fusionado a la chaperona para garantizar la accesibilidad de la C-terminal motivo MEEVD unión de HSP90 para sujetar tipo dominios TPR. En paralelo, la parte N-terminal de Venus (Venus ^N) se fusionó a los dominios citosólicos de la TPR dominio que contiene proteínas de acoplamiento Toc64 y AtTPR7, respectivamente. Como control negativo se clonó la parte C-terminal soluble de SCFP ^C únicamente que reside en el citosol y por lo tanto es un control apropiado.

Las etiquetas fluorescentes de las proteínas estudiadas tienen que enfrentar el mismo compartimento celular para permitir la proximidad y por lo tanto la reconstitución de la señal fluorescente. Para determinar la localización de la señal fluorescente reconstituido una proteína marcador fusionado a una etiqueta fluorescente diferente puede ser cotransformado para demostrar la localización subcelular de la interacción. Una proteína marcador ER fusionado a mCherrry fue transformado simultáneamente en elcaso de la sala de emergencia situada AtTPR7 ^14. La autofluorescencia de la clorofila se desempeñó como marcador de cloroplasto en caso de Toc64. Por esto no sólo la interacción in vivo de Toc64 y AtTPR7, respectivamente, con la chaperona HSP90 citosólica se puede monitorizar directamente en las hojas de tabaco, sino también la localización subcelular de la interacción puede ser investigado.

BiFC Es muy adecuado como un enfoque complementario a otros métodos que estudian las interacciones proteína-proteína. En comparación con coimmunoprecipitation o en experimentos de pull-down in vitro, por ejemplo, no hay anticuerpos específicos tienen que estar disponibles para las proteínas de interés, y las proteínas no tienen que ser expresadas de forma recombinante in vitro, que puede ser un reto, especialmente para las proteínas de membrana. Por otra parte, también interacciones transitorias pueden ser controlados usando BiFC, ya que las proteínas son capturados por la interacción de las etiquetas fluorescentes fusionados ^15.

Protocol

1. Transformación de BiFC construcciones en las agrobacterias Clonación de construcciones BiFC Amplificar el gen de interés a partir de una plantilla adecuada utilizando oligonucleótidos que contienen sitios que flanquean attB-. Lleve a cabo una PCR utilizando una corrección de la polimerasa. Adaptar la longitud de la etapa de recocido a la combinación de cebadores diseñado y la longitud de la etapa de elongación de acuerdo con el tamaño del fragmento. Compruebe el producto de la PCR por ele…

Representative Results

En este ejemplo se utilizó el método BiFC para supervisar la interacción de la HSP90 citosólica chaperona molecular con las proteínas de unión a las membranas AtTPR7 y Toc64. AtTPR7 es parte de la translocón Sec y interactúa con chaperonas citosólicas, que posiblemente entregan preproteínas secretora para la translocación post-traducción a la membrana del RE. Del mismo modo, Toc64 en el sobre exterior cloroplasto actúa en la importación después de la traducción mediante la recepción de HSP90 preproteín…

Discussion

Después de la planificación de un experimento BiFC deben considerarse varios puntos. Aunque no se requiere ninguna información estructural de las proteínas de interés, la topología tiene que ser conocido cuando se trabaja con proteínas de membrana que abarca. Las proteínas fluorescentes tienen que residir en el mismo compartimento subcelular o enfrentar el mismo lado de una membrana para permitir la interacción. Naturalmente, cuando el análisis de proteínas que requieren una secuencia de orientación N-termin…

Materials

3',5'-Dimethoxy-4'-hydroxyacetophenone	Sigma-Aldrich	D134406	Acetosyringone
Cellulase, Onozuka-R10	Serva	16419	from Trichoderma viridae
Macerozyme R-10	Serva	28302	from Rhizopus sp
GATEWAY, BP Clonase II, Enzyme Kit	Invitrogen	11789-(020)
GATEWAY, LR Clonase II, Enzyme Kit	Invitrogen	11791-(020)
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit	Macherey-Nagel	740609-250
pDEST-GWVYNE		Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant	Gateway-cloning (Invitrogen)
pDEST-VYNE(R)GW		Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant	Gateway-cloning (Invitrogen)
pDEST-SCYCE(R)GW		Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant	Gateway-cloning (Invitrogen)