タバコプロトプラストと葉で二分子蛍光相補性によって可視化し、タンパク質間相互作用
Summary
インビボでのタンパク質複合体の形成は、二分子蛍光相補性によって視覚化することができる。相互作用パートナーは、蛍光タグの相補的部分に融合し、一過性にタバコの葉で表現、2つのタンパク質の接近したとき、再構成可能な蛍光シグナルをもたらしている。
Abstract
多くのタンパク質は他のタンパク質と一過性に相互作用するか、それらの生物学的機能を実行するために多タンパク質複合体に組み込まれる。二分子蛍光相補性（BIFC）は、植物細胞内でこのような相互作用を監視するin vivo法である。提示されたプロトコルで調べ候補タンパク質は、蛍光タンパク質の相補的な半分に融合され、各構築物は、アグロバクテリウム媒介形質転換を介して植物細胞に導入される。続いて、タンパク質を一過性にタバコの葉において発現され、復元された蛍光シグナルは、無傷の細胞における共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて検出することができる。これは、相互作用自体だけでなく可視化を可能にするだけでなく、タンパク質複合体の細胞内局在を決定することができる。この目的のために、蛍光タグを含むマーカー遺伝子は、従って、例えば、tのような細胞構造を視覚化する、BIFC構築物とともに同時発現され得る彼は胞体、ミトコンドリア、ゴルジ装置または原形質膜を小胞体。蛍光シグナルは直接葉表皮細胞において、または容易に形質転換されたタバコの葉から単離することができる単一のプロトプラスト、のいずれかでモニターすることができる。 BIFCは、理想的には、生細胞内でそれらの天然の環境の中でのタンパク質 – タンパク質相互作用を研究するために適している。しかしながら、発現が強力なプロモーターによって駆動されなければならず、相互作用パートナーを相互作用による機構を妨害する可能性があり、比較的大きな蛍光タグの融合物に変更されていることを考慮しなければならない。それにもかかわらず、BIFCは、例えば共免疫沈降、タンパク質-タンパク質相互作用、 インビトロでのプルダウンアッセイまたは酵母ツーハイブリッド実験を調査する他の一般的に適用される方法への優れた相補的なアプローチである。
Introduction
タンパク質複合体の形成を研究およびインビボでの植物細胞におけるそれらの局在化は、セルラーネットワークを調査するために不可欠であり、シグナリングおよび代謝プロセス。 BIFCを直接生きた植物細胞1-5内でのそれらの天然の環境におけるタンパク質-タンパク質相互作用の可視化を可能にする。
BIFC中で再構成した蛍光タンパク質と蛍光タンパク質鉛の二非蛍光N-およびC-末端フラグメントの相補性に近づく。多くの異なる蛍光タンパク質の断片タンパク質相互作用を検出するために使用されており、 例えば、緑色蛍光タンパク質（GFP）、化学的に三つの異なる残基6によって形成された発色団。蛍光タンパク質は、目的の両方のタンパク質に融合させることができる2つの非蛍光フラグメントを生じ、ループ又はβ-ストランド内半減することができる。アッセイは、任意の細胞内compartmeにおける相互作用を検出するために使用することができるntの遺伝子的に融合タンパク質を発現するように修飾することができる任意の好気的に成長する生物または細胞において。 2つのタンパク質が、細胞内で近接するようになった場合は、蛍光が再構成され、外因性蛍光団又は染料3を添加せずに顕微鏡によりモニターすることができる。
タンパク質は容易にタバコのアグロバクテリウム媒介形質転換を利用して表現することができるので、タバコ（ ニコチアナ·ベンサミアナ ） が発生構築物、葉、植物タンパク質との相互作用を可視化するための便利なモデル生物であることが証明された。アグロバクテリウムは、植物細胞に目的の遺伝子の伝達を媒介する酵素をコードする、いわゆるTiプラスミド（腫瘍誘発）を使用します。 BIFCは、可溶性のためだけでなく、すべての細胞区画内膜タンパク質のための十分に適用可能であり、成功して、生体内でのタンパク質相互作用識別するだけでなく、相互作用部位を分析するために、過去数年にわたり使用されてきた7-9タンパク質内。導入された遺伝子の発現の際に、蛍光タンパク質の相互作用は、例えば、小胞体（ER）などのより大きな細胞構造、原形質膜又は葉緑体に適している、葉を直接可視化することができる。しかし、より洗練された構造における局在化を監視するために、例えば、葉緑体エンベロープは、形質転換タバコの葉から単離されたプロトプラストの蛍光を可視化することが望ましい。 C-末端またはN-末端蛍光タグのいずれかを含むBIFCベクトルのセット10は、植物におけるBIFCアプローチのために使用されなければならない。後述のプロトコルは、テトラトリコペプチド反復タンパク質ドッキングToc64とAtTPR7は葉緑外側エンベロープそれぞれ小胞体、11-13に存在する含有（TPR）ドメインと細胞質ゾルの熱ショックタンパク質90（HSP90）の相互作用を研究するために使用した。この目的のために、HSP90は、Ctを融合させたSCFPのerminal一部（SCFP C）。タグは、N末端TPRドメイン型クランプするHSP90のC末端MEEVD結合モチーフのアクセシビリティを確保するためにシャペロンに融合した。並行して、ビーナス（金星N）のN末端 部分は、それぞれ、ドッキングタンパク質Toc64とAtTPR7を含むTPRドメインの細胞質ゾルドメインに融合した。ネガティブコントロールとして、我々は細胞質ゾルに存在し、したがって、適切なコントロールであるだけにSCFP Cの可溶性C末端部分をクローニングした。
研究されたタンパク質の蛍光標識は、近接することにより、蛍光シグナルの再構成を可能にするために、同じ細胞区画に直面している。再構成された蛍光シグナルの局在を決定するために、異なる蛍光タグに融合されたマーカータンパク質の相互作用の細胞内局在を実証するために同時形質転換することができる。 mCherrryに融合ERマーカータンパク質は、同時に形質転換したAtTPR7 14に位置し、ER例。クロロフィルの自家蛍光はToc64例で葉緑のマーカーを務めた。これにより細胞質ゾルのHSP90シャペロンとそれぞれToc64とAtTPR7のin vivoでの相互作用だけでなく、タバコの葉を直接監視することができるだけでなく、相互作用の細胞内局在を調べることができる。
BIFCは、タンパク質 – タンパク質相互作用を研究する他の方法に相補的なアプローチとして適している。免疫共沈降する又はインビトロプルダウン実験で比較し、例えば、特定の抗体は、目的のタンパク質に利用可能である必要はなく、タンパク質、特に膜タンパク質のために、挑戦することができる、組換えによってin vitroで発現される必要はない。蛋白質が融合した蛍光タグ15との相互作用によって捕捉されるので、また一時的な相互作用は、BIFCを用いてモニターすることができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
BIFC実験を計画する際に、いくつかの点を考慮する必要があります。目的のタンパク質についての構造情報は必要ありませんが、トポロジー、膜貫通タンパク質で作業するとき知る必要がある。蛍光タンパク質は、同じ細胞内区画内に存在する又は相互作用を可能にするために、膜の同じ側に直面している。 N末端標的化配列を必要とするタンパク質を分析する場合、当然、唯一のC-末端タグ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、原稿の重要な読書のための有用な議論とクリスキャリーのためのユルゲン·Sollのに感謝したいと思います。このプロジェクトは、（SSに助成金番号SFB 1035、プロジェクトA04とRSに22分の187の操作を行います）、DFGとフォン·デア·chemischenインダストリーによって資金を供給された。
Materials
| 3',5'-Dimethoxy-4'-hydroxyacetophenone | Sigma-Aldrich | D134406 | Acetosyringone |
| Cellulase, Onozuka-R10 | Serva | 16419 | from Trichoderma viridae |
| Macerozyme R-10 | Serva | 28302 | from Rhizopus sp |
| GATEWAY, BP Clonase II, Enzyme Kit | Invitrogen | 11789-(020) | |
| GATEWAY, LR Clonase II, Enzyme Kit | Invitrogen | 11791-(020) | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609-250 | |
| pDEST-GWVYNE | Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant | Gateway-cloning (Invitrogen) | |
| pDEST-VYNE(R)GW | Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant | Gateway-cloning (Invitrogen) | |
| pDEST-SCYCE(R)GW | Gehl C. et al, 2009, Molecular Plant | Gateway-cloning (Invitrogen) | |
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